【摘 要】
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目的:肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统的改变在体外循环术后肺损伤形成肺水肿的过程中起着重要作用。我们前期研究表明巨噬细胞与肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统有关,但是具体巨噬细胞是怎么影响肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统的还有待进一步探讨。因此本实验采用共培养模型探究不同极化类型的巨噬细胞对肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统带来的变化。实验方法:
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目的:肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统的改变在体外循环术后肺损伤形成肺水肿的过程中起着重要作用。我们前期研究表明巨噬细胞与肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统有关,但是具体巨噬细胞是怎么影响肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统的还有待进一步探讨。因此本实验采用共培养模型探究不同极化类型的巨噬细胞对肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统带来的变化。实验方法:本研究通过对完成鉴定的肺微血管内皮细胞（HPMEC）和肺泡上皮细胞（HPAEpi C）进行缺复氧损伤细胞模型的建立,然后在缺复氧损伤细胞模型的基础上,分别加入LPS（100ng/ml）促进巨噬细胞向M1极化和加入IL-4（20ng/ml）使巨噬细胞向M2极化,观察不同极化类型的巨噬细胞对肺血管内皮细胞通透性和肺泡上皮细胞钠水转运系统带来的变化,包括ELISA检测巨噬细胞胞外炎症因子IL-1、TNF-α、i NOS、IL-10的释放,WB检测磷酸化MLC蛋白水平表达变化,Ena C、AQP1、NKA的m RNA和蛋白表达水平变化和细胞内Ca2+浓度的改变。进一步通过免疫荧光观察骨架蛋白（F-actin）改变了解内皮细胞收缩情况,观察血管内皮细胞钙粘蛋白（VE-cadherin）和连环蛋白（β-catenin）的表达情况了解细胞间间隙的改变情况,以及观察内皮细胞粘着斑激酶（FAK）和桩蛋白（paxillin）的情况了解细胞与基质间间隙的改变情况。实验结果:首先通过验证巨噬细胞M1极化标志物CD86的基因表达量显著增加和巨噬细胞M2极化标志物CD206的基因表达量显著增加表明肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞缺复氧损伤模型细胞（HPMEC-model和HPAEpi C-model）的巨噬细胞M1和M2极化成功。在此基础上我们发现缺复氧损伤后,巨噬细胞M1型极化导致促炎因子IL-1、TNF-α和i NOS进一步增加,同时巨噬细胞M2型极化则导致促炎因子TNF-α和i NOS表达减少而抑炎因子IL-10表达升高,以上结果均具有统计学意义（P＜0.05）,从而我们推测在缺复氧损伤后诱导巨噬细胞M2极化可能通过抑制炎症来进一步降低肺血管内皮细胞通透性。此外,免疫荧光结果显示,缺复氧损伤后HPMEC细胞之间间隙有所增大,细胞边缘模糊,细胞与细胞之间连接之处VE-cadherin,β-catenin,FAK,F-actin和paxillin的表达水平明显减少;而缺复氧损伤诱导巨噬细胞M2极化后内皮细胞排列较之前整齐,细胞边缘清楚,细胞间隙明显减少,细胞与细胞之间连接处可见VE-cadherin,β-catenin,FAK,F-actin和paxillin的表达,进一步表明缺复氧损伤后诱导巨噬细胞M2极化可以降低肺血管内皮细胞通透性。最后,通过m RNA和蛋白表达水平验证Ena C、AQP1、NKA表达,我们发现缺复氧损伤后诱导巨噬细胞M2型极化导致Ena C、NKA表达明显增加,提示诱导巨噬细胞M2型极化可能增强肺泡上皮细胞水钠转运。上述结果表明,缺复氧损伤后诱导巨噬细胞M2型极化可以抑制肺血管内皮细胞通透性和增强肺泡上皮细胞钠水转运系统。可以为体外循环术后肺损伤形成的肺水肿的治疗提供新思路,有利于临床上患者体外循环术后肺损伤的恢复。结论:缺复氧损伤后诱导巨噬细胞M2型极化可以抑制肺血管内皮细胞通透性和增强肺泡上皮细胞钠水转运系统。
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