【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种球形、带囊膜的单股正链RNA病毒,主要造成妊娠母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病。其弱毒活疫苗和灭活疫苗都无法为猪群提供安全有效的免疫保护,开展新型疫苗研发是防控该病的关键措施之一。反向遗传学构建重组病毒技术是开展新型疫苗研究的重要技术平台,该技术也可以应用于
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种球形、带囊膜的单股正链RNA病毒,主要造成妊娠母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病。其弱毒活疫苗和灭活疫苗都无法为猪群提供安全有效的免疫保护,开展新型疫苗研发是防控该病的关键措施之一。反向遗传学构建重组病毒技术是开展新型疫苗研究的重要技术平台,该技术也可以应用于PRRSV蛋白功能、致病机制等领域的研究。本研究开展PRRSV/ZJ-JX/2015临床分离毒株的全基因组序列测定,利用CLC Sequence Viewer 8和MEGA 7.0软件进行序列比对分析。全基因组核苷酸进化分析说明PRRSV/ZJ-JX/2015毒株属于基因II型HP-PRRSV。氨基酸比对分析表明,其Nsp2氨基酸相比2015年华东地区毒株序列存在38处明显差异,而GP5氨基酸序列中59、114、164位存在明显差异。本研究将PRRSV/ZJ-JX/2015毒株基因组分为四个片段分段扩增,利用一步法同源重组技术,将PRRSV/ZJ-JX/2015毒株基因组c DNA分别构建到p SMART-BAC质粒和p WSK-29质粒,获得两种PRRSV/ZJ-JX/2015全长感染性克隆质粒。利用定点突变技术,在其基因组第4821位处引入无义突变（C-G）,形成Bst B I酶切位点作为鉴定用的遗传标记。将基于CMV启动子的p SMART-BAC-CMV-r PRRSV质粒分别转染BHK-21和293T细胞,分别拯救出重组病毒（BHK-CMV-r JX15和293T-CMV-r JX15）。将基于T7启动子的p WSK-29-T7-r PRRSV质粒转染BHK-21（T7）细胞（携带T7启动子聚合酶基因的稳转细胞系）,拯救出重组病毒（BHK-T7-r JX15）。结果表明:重组病毒BHK-CMV-r JX15在MARC-145细胞上传至F2代,感染48 h后出现明显病变,连续传代至F5代,病变趋于稳定。重组病毒293T-CMV-r JX15在MARC-145细胞上则需传至F4代,48 h出现明显病变,传代至F6代病变趋于稳定。重组病毒BHK-T7-r JX15在MARC-145细胞上传至F6代48 h出现明显病变,传代至F8代48 h病变趋于稳定。三种重组病毒分别感染MARC-145细胞,Western boltting、IFA检测结果表明:PRRSV N蛋白能在重组病毒感染的细胞沉淀中被检出,活细胞内细胞核内存在特异性绿色荧光信号,且细胞病变区域荧光信号较强。利用PCR方法扩增出含遗传标记位点的片段（544bp）,进行Bst B I酶酶切验证,可切出270bp和274bp的片段,测序比对分析表明该位点序列为（C-G）无义突变。重组病毒经空斑纯化后分别测定其TCID50,结果表明:BHK-CMV-r JX15的F5代为105.8、293T-CMV-r JX 15的F6代为104.2、BHK-T7-r JX15的F8为103.6。一步生长曲线结果表明:BHK-CMV-r JX15和293T-CMV-r JX15毒株与亲本毒株具有更加相似的生长规律。本研究成功构建了PRRSV反向遗传重组病毒拯救系统,为开展PRRSV弱毒活疫苗、致病机理和病毒生物学研究提供了技术平台。
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