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研究目的本课题组前期动物实验研究表明益肾蠲痹丸能改善卵巢切除胶原诱导性关节炎（Collagen Induced Arthritis,CIA）大鼠踝关节的肿胀程度及跗骨骨表面骨微观结构的破坏,减轻关节局部炎细胞浸润、滑膜增生及软骨与骨的破坏。其机制与上调ephrinB2蛋白,抑制破骨细胞（Osteoblast,OC）分化和活性的过度增强密切相关。在此基础上,本研究通过制备肾虚（卵巢切除）CIA模型的益肾蠲痹丸含药血清,采用小鼠脾脏单核细胞和骨髓单核巨噬细胞体外诱导分化破骨细胞的方法,从ephrinB2信号通路角度揭示益肾蠲痹丸调控破骨细胞分化及功能的作用机制,以期为“肾主骨”理论提供进一步的实验依据,同时也为绝经后类风湿关节炎“从肾论治”提供进一步的实验依据。研究方法1含药血清的制备选用SPF级雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠35只,适应性饲养后按体重随机分为3组:空白对照（Control）组5只、CIA组7只和卵巢切除（OVX）组23只。对OVX组行双侧卵巢切除术,制备“肾虚”OVX大鼠模型。12周后将卵巢切除大鼠,随机选取5只为OVX组,其余卵巢切除大鼠和CIA组大鼠采用Ⅱ型胶原免疫制作CIA模型。Ⅱ型胶原免疫14 d后,剔除未发病的大鼠。将卵巢切除CIA大鼠按关节肿胀度随机分为3组:卵巢切除CIA（OVX+CIA）、卵巢切除CIA+戊酸雌二醇（OVX+CIA+EV）组、卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸（OVX+CIA+YSJB）组。OVX+CIA+YSJB组大鼠灌服0.3g/mL益肾蠲痹丸水溶液,OVX+CIA+EV组大鼠灌服0.0184mg/ml戊酸雌二醇水溶液,给药体积均为 1ml/100g,一日 2 次,连续 5d。Control 组、OVX 组、CIA 组、OVX+CIA组按以上程序,灌服等容积的纯净水。末次给药/水1h后麻醉,经腹主动脉无菌条件下采血,离心（2500r/min,4℃,25min）,分离血清,过滤除菌后分装-80℃保存备用。2小鼠脾脏单核细胞诱导分化破骨细胞及相关检测无菌条件下提取7-8周C57BL/6小鼠脾脏单核细胞,使用完全培养基（10%FBS的α-MEM培养基）培养,种植于96孔培养板（5×105个/孔）、预置有骨片的96孔培养板（5×105个/孔）、24孔培养板（3×106个/孔）中。2h后弃上清,加入分化培养基（25ng/ml M-CSF,50ng/ml RANKL,完全培养基）培养,隔天换液,96h后给予5%含药血清的分化培养基。给药48h后:96孔培养板细胞做TRAP染色,观察拍照,统计TRAP+破骨细胞的数量;收集24孔板细胞,采用Real-time PCR检测OC分化中相关转录调控因子（c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank、Efnb2）mRNA的表达;预置有骨片的96孔培养板换成分化培养基培养至第11d,收集骨片做甲苯胺蓝染色,观察拍照骨陷窝形态,并采用Leica Qwin图像分析系统对骨陷窝面积进行分析。3小鼠骨髓单核巨噬细胞诱导分化破骨细胞及相关检测无菌条件下提取7-8周C57BL/6小鼠股骨及胫骨骨髓细胞,24h后收集悬浮细胞液,用分化培养基（25ng/ml M-CSF,完全培养基）培养,种植于96孔培养板（5×104个/孔）、预置有骨片的96孔培养板（5 ×104个/孔）、24孔培养板（3× 105个/孔）中。隔天换液,72h后给予5%含药血清的分化培养基（25ng/ml M-CSF,50ng/ml RANKL,完全培养基）,给药48h后:收集96孔板细胞进行TRAP染色,观察拍照,统计TRAP+破骨细胞的数量;收集24孔板细胞,采用Real-time PCR检测OC分化中相关转录调控因子（c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank、Efnb2）mRNA的表达;预置有骨片的96孔培养板换成分化培养基培养至第11d,收集骨片做甲苯胺蓝染色,观察拍照骨陷窝形态,并采用Leica Qwin图像分析系统对骨陷窝面积进行分析。4破骨细胞敲减ephrinB2基因的方法及相关检测按照上述方法提取培养两种细胞,96h后进行转染,加入ephrinB2 siRNA6h后,换成5%含药血清的分化培养基继续培养48h后:收集96孔板细胞进行TRAP染色,观察拍照,统计TRAP+破骨细胞的数量;24孔板采用Real-time PCR检测OC分化中相关转录调控因子（c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank）mRNA的表达;预置骨片的换成分化培养基培养至第11d,收集骨片做甲苯胺蓝染色,拍照观察骨陷窝形态,并采用Leica Qwin图像分析系统对骨陷窝面积进行分析。研究结果1益肾蠲痹丸对OC分化及功能（脾脏来源）的影响1.1益肾蠲痹丸对OC分化数目的影响与空白对照血清组相比较,卵巢切除CIA血清组的破骨细胞数量明显增加（P<0.05）;CIA血清组、卵巢切除血清组有升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞数量明显下降（P<0.05）。1.2益肾蠲痹丸对OC所致的骨侵蚀的影响与空白对照血清组相比较,卵巢切除CIA血清组、卵巢切除血清组的破骨细胞所致的骨吸收陷窝面积明显增加（P<0.05,P<0.01）;CIA血清组有升高趋势,但无统计学差异。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞侵蚀所致的骨陷窝面积明显下降（P<0.05,P<0.01）。1.3益肾蠲痹丸对OC分化相关转录调控因子mRNA表达的影响与空白对照血清组相比较,卵巢切除CIA血清组的c-Fos mRNA表达显著升高（P<0.01）;CIA血清组、卵巢切除血清组有升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,c-Fos mRNA表达有下降的趋势但无统计学差异（P>0.05）。与空白对照血清组相比较,卵巢切除CIA血清组的c-Jun mRNA表达显著增加（P<0.01）;CIA血清组、卵巢切除血清组有升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）。卵巢切除CIA血清组的c-JunmRNA表达显著高于CIA血清组和卵巢切除血清组（P<0.01）。与卵巢切除CIA血清组相比,卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组c-Jun mRNA表达明显下降（P<0.05）,卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组的c-Jun mRNA表达有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。与空白对照血清组相比较,CIA血清组、卵巢切除血清组、卵巢切除CIA血清组Nfatc1 mRNA表达明显增加（P<0.05,P<0.01）;卵巢切除CIA血清组Nfatc1 mRNA表达显著高于CIA血清组和卵巢切除血清组（P<0.05）。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,Nfatc1 mRNA表达明显下降（P<0.05,P<0.01）。与空白对照血清组相比较,卵巢切除CIA血清组Rank mRNA表达显著增加（P<0.01）;卵巢切除CIA血清组Rank mRNA表达显著高于CIA血清组和卵巢切除血清组（P<0.01）。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,RankmRNA表达明显下降（P<0.01,P<0.05）。1.4益肾蠲痹丸对OC Efnb2（encoding ephrinB2）mRNA表达的影响卵巢切除CIA血清组破骨细胞Efnb2 mRNA的表达显著低于空白对照血清组（P<0.01）;CIA血清组、卵巢切除血清组有下降的趋势,但无统计学差异。与卵巢切除CIA血清组相比,卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组破骨细胞Efnb2mRNA的表达明显升高（P<0.05）。2益肾蠲痹丸对OC（骨髓来源）分化及功能的影响2.1益肾蠲痹丸对OC分化数目的影响与空白对照血清组相比较,卵巢切除血清组和卵巢切除CIA血清组的破骨细胞数量明显增加（P<0.05,P<0.01）;卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞数量明显下降（P<0.05）。2.2益肾蠲痹丸对OC所致的骨侵蚀的影响与空白对照血清组相比较,卵巢切除血清组和卵巢切除CIA血清组的破骨细胞导致的骨陷窝面积明显增加（P<0.05,P<0.01）;CIA血清组有升高的趋势,但无统计学差异。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞侵蚀所致的骨陷窝面积明显下降（P<0.05）。2.3益肾蠲痹丸对OC分化相关转录调控因子mRNA表达的影响与空白对照血清组相比较,卵巢切除CIA血清组的c-Fos mRNA表达显著增加（P<0.01）;CIA血清组、卵巢切除血清组有升高的趋势,但无统计学差异。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,c-FosmRNA表达有下降的趋势但无统计学差异。与空白对照血清组相比较,卵巢切除CIA血清组的c-Jun mRNA表达显著增加（P<0.01）;CIA血清组、卵巢切除血清组有升高的趋势,但无统计学差异。卵巢切除CIA血清组c-Jun mRNA表达显著高于CIA血清组和卵巢切除血清组（P<0.01）。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,c-Jun mRNA表达明显下降（P<0.05）。与空白对照血清组相比,卵巢切除血清组、CIA血清组、卵巢切除CIA血清组Nfatc1 mRNA表达明显增加（P<0.05,P<0.01）;卵巢切除CIA血清组Nfatc1 mRNA表达显著高于CIA血清组和卵巢切除血清组（P<0.01）。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切除CIA血清组相比,Nfatc1 mRNA表达显著下降（P<0.01）。与空白对照血清组相比较,卵巢切除血清组、卵巢切除CIA血清组的Rank mRNA表达明显增加（P<0.05,P<0.01）;卵巢切除CIA血清组Rank mRNA表达明显高于CIA血清组和卵巢切除血清组（P<0.05）。卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与卵巢切CIA血清组相比,Rank mRNA表达明显下降（P<0.05）。2.4益肾蠲痹丸对OC Efnb2（encoding ephrinB2）mRNA表达的影响卵巢切除CIA血清组破骨细胞的Efnb2 mRNA表达显著低于空白对照血清组（P<0.01）;CIA血清组、卵巢切除血清组有下降的趋势,但无统计学差异。与卵巢切除CIA血清组相比,卵巢切除CIA+戊酸雌二醇血清组和卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组破骨细胞Efnb2mRNA的表达明显升高（P<0.05）。3EphrinB2对益肾蠲痹丸调控OC（脾脏来源）分化及功能的影响3.1 EphrinB2对益肾蠲痹丸调控OC数目的影响转染ephrinB2 siRNA后,ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞的数量显著升高（P<0.01）。与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,NC siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组破骨细胞的数量明显减少（P<0.05）。ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞数量有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。3.2 EphrinB2对益肾蠲痹丸调控OC所致的骨侵蚀的影响ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞所致的骨吸收陷窝面积明显升高（P<0.05）。与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,NC siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组破骨细胞所致的骨吸收陷窝面积明显减少（P<0.01）。转染ephrinB2 siRNA后,ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞侵蚀所致的骨吸收陷窝面积有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。3.3 EphrinB2对益肾蠲痹丸调控破骨细胞分化相关转录调控因子mRNA表达的影响ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank mRNA 的表达明显升高（P<0.05,P<0.01）。与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,NC siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组c-Jun、Nfatc1、Rank mRNA的表达明显下降（P<0.05）,c-Fos有下降的趋势,但无统计学差异（P>0.05）。转染 ephrinB2 siRNA 后,ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank mRNA的表达有下降的趋势,但差异不明显（P>0.05）。4EphrinB2对益肾蠲痹丸调控OC（骨髓来源）分化及功能的影响4.1 EphrinB2对益肾蠲痹丸调控OC数目的影响与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,NC siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组的OC数量明显减少（P<0.05）。ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,OC数量显著升高（P<0.01）,转染ephrinB2 siRNA后,ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞数量有下降的趋势,但无统计学差异（P>0.05）。4.2 EphrinB2对益肾蠲痹丸调控OC所致的骨侵蚀的影响ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞所致的骨吸收陷窝面积明显升高（P<0.05）。与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,NC siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组破骨细胞所致的骨陷窝面积明显减少（P<0.05）。转染ephrinB2 siRNA后,ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,破骨细胞侵蚀所致的骨陷窝面积有下降的趋势,但没有统计学差异（P>0.05）。4.3 EphrinB2对益肾蠲痹丸调控OC分化相关转录调控因子mRNA表达的影响ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank mRNA 的表达明显升高（P<0.05,P<0.01）。与NC siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,NC siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组c-Jun、Nfatc1、Rank mRNA的表达明显下降（P<0.05）,c-Fos有下降的趋势,但无统计学差异（P>0.05）。转染 ephrinB2 siRNA 后,ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA+益肾蠲痹丸血清组与ephrinB2 siRNA+卵巢切除CIA血清组相比,c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank mRNA的表达有下降的趋势,但差异不明显（P>0.05）。结论（1）益肾蠲痹丸可通过上调破骨细胞分化负调控因子ephrinB2的表达,下调破骨细胞转录因子c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank的表达,抑制小鼠骨髓和脾脏来源的破骨细胞前体向破骨细胞的分化及功能。（2）敲减ephrinB2基因可减弱益肾蠲痹丸对破骨细胞分化/功能及破骨细胞转录因子c-Fos、c-Jun、Nfatc1、Rank表达的调控,表明ephrinB2信号通路是益肾蠲痹丸发挥抑制破骨细胞分化及功能的关键环节之一。