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目的:针刺对哮喘气道炎症有显著调控作用,前期研究显示针刺显著上调哮喘气道CC10蛋白表达,进一步研究发现CC10蛋白能够改善哮喘模型呼吸功能,抑制气道平滑肌细胞的增殖和迁移,提示CC10是针刺抗哮喘效应蛋白之一。但是CC10在哮喘气道炎症中的作用与机制,以及CC10在针刺调控哮喘炎症中的作用尚不清楚。本研究拟利用CRISP/Cas9技术构建CC10基因敲除小鼠(CC10-/-),并建立CC10-/-小鼠哮喘模型,观察CC10基因敲除对屋尘螨(House dust mite,HDM)诱导的哮喘模型气道炎症的影响,比较针刺对野生型(WT)和CC10-/-小鼠哮喘模型的治疗作用,同时研究针刺后哮喘模型肺部树突状细胞(Dendritic cells,DCs)数量和表型的变化。本研究将明确CC10蛋白在针刺抗哮喘过程中作用,揭示CC10在调控哮喘气道炎症中的作用与机制,为基于针刺抗哮喘效应蛋白创新哮喘防治策略提供科学依据。方法:1.选择Scgbla1基因的exon2为敲除区域,通过体外转录的方式获得Cas9mRNA和gRNA,将两者显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠,F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得杂合子小鼠,杂合子自交获得纯合子小鼠。利用PCR进行CC10敲除小鼠基因型鉴定,通过Western Blot验证基因敲除的效果。2.HDM诱导哮喘模型的制备:WT小鼠和CC10-/-小鼠在第0天和第7天用10μg HDM通过鼻腔滴注给药方式致敏2次。从第8天开始针刺干预,选取大椎、双侧肺俞、风门,隔天针刺一次,每次留针20 min,一共针刺7次。第14-20天用20μg HDM连续7天滴鼻激发小鼠。3.实验动物分组:(1)WT对照组:WT-NS,野生型小鼠用生理盐水滴鼻致敏、激发;(2)WT模型组:WT-AS,野生型小鼠用HDM滴鼻致敏、激发;(3)WT模型针刺组:WT-AA,野生型小鼠用HDM滴鼻致敏、激发,并加以针刺干预;(4)KO对照组:KO-NS,CC10-/-小鼠用生理盐水滴鼻致敏、激发;(5)KO模型组:KO-AS,CC10-/-小鼠用HDM滴鼻致敏、激发;(6)KO模型针刺组:KO-AA,CC10-/-小鼠用HDM滴鼻致敏、激发,并加以针刺干预。4.小鼠雾化吸入不同浓度(0 mg/ml、1.5 mg/ml、3 mg/ml、6 mg/ml)的乙酰甲胆碱(Methacholine,Mch),利用小动物呼吸检测系统(Resisitance and Comliance system)检测呼吸功能;收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),利用动物血液细胞分析仪进行白细胞总数及分类计数;用ELISA试剂盒检测BALF中细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的水平以及血清HDM特异性IgE的水平;取脾脏进行脾脏指数分析;取肺组织进行肺组织病理切片和HE染色。5.通过PE-CD11c、FITC-MHC II、APC-CD103、PE-Cy7-CD11b等荧光抗体染色,用流式细胞仪检测小鼠BALF中DCs数量与表型变化。结果:1.通过CRISPR/Cas9技术构建了CC10-/-小鼠,PCR与Western Blot验证CC10基因敲除成功,CC10-/-小鼠的生理学特征无异常,可用于后续实验。2.与对照组相比,雾化6 mg/ml的Mch后,WT-AS和KO-AS的气道阻力均明显升高(P<0.05),WT-AS和KO-AS组比较无统计学差异。与模型组比较,WT-AA与KO-AA组气道阻力均明显下降,WT-AA与KO-AA组相比无统计学差异。3.与对照组相比,WT-AS和KO-AS的BALF中白细胞总数均显著升高(均P<0.01),且KO-AS组高于WT-AS组(P<0.01)。与模型组比较,WT-AA与KO-AA组白细胞总数显著下降(P<0.05,P<0.01),WT-AA与KO-AA相比无统计学差异。4.与对照组相比,WT-AS和KO-AS的BALF中嗜酸性粒细胞(Eos)、淋巴细胞(Lym)、中性粒细胞(Neu)、单核细胞(Mon)数目均显著升高(均P<0.01),且KO-AS组高于WT-AS组(Neu,P<0.01;Lym,P<0.01;Eos,P<0.05)。与模型组比较,WT-AA组治疗后Eos、Neu与Mon细胞数均明显降低(均P<0.05);KO-AA组治疗后Eos、Neu、Lym和Mon细胞数均显著降低(P<0.05、P<0.01、P<0.05、P<0.05)。WT-AA组与KO-AA组比较Eos、Neu和Lym细胞数无统计学差异。WT-AA组对Eos,Neu和Mon细胞计数的抑制效率分别是KO-AA组的1.17倍,1.26倍和1.6倍。5.与对照组相比,WT-AS和KO-AS组的脾脏指数显著升高(均P<0.01)。WT-AS和KO-AS组比较无统计学差异。与模型组比较,WT-AA和KO-AA组治疗后脾脏指数均降低(均P<0.01),WT-AA和KO-AA组相比无统计学差异。6.与对照组相比,WT-AS和KO-AS组肺组织炎症评分显著升高(均P<0.01),且KO-AS组高于WT-AS组(P<0.05)。与模型组比较,WT-AA与KO-AA组在治疗后肺组织炎症评分明显降低(均P<0.01),WT-AA与KO-AA组相比无统计学差异。WT-AA组对肺组织炎症评分的抑制效率是KO-AA组的1.27倍。7.与对照组相比,WT-AS组BALF中IL-4与IL-5的表达显著升高(均P<0.01),而IL-13的表达升高,但是无统计学差异;KO-AS组BALF中IL-4、IL-5与IL-13表达显著升高(均P<0.01)。KO-AS组IL-4、IL-5和IL-13的表达均高于WT-AS组,其中IL-13表达在两组间比较有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,WT-AA和KO-AA组治疗后BALF中IL-4、IL-5表达显著降低(均P<0.01),其中两组间IL-4的表达相比无统计学差异,而WT-AA组对IL-5表达的抑制效率是KO-AA组的1.2倍(P<0.05)。8.与对照组相比,WT-AS和KO-AS组血清中HDM特异性IgE的表达显著升高(均P<0.01),WT-AS和KO-AS组比较无统计学差异。与模型组比较,WT-AA和KO-AA组治疗后血清中HDM特异性IgE的表达下降(均P<0.05),WT-AA与KO-AA组相比无统计学差异。WT-AA组对血清HDM特异性IgE表达的抑制效率是KO-AA组的1.1倍。9.KO-NS组与WT-NS比较,DCs总数显著降低(P<0.01)。WT-AS组肺内DCs(CD11c+MHC II+)总数与对照组相比明显降低(P<0.05),CD11b+DCs的比例显著升高(P<0.05)。WT-AA组治疗后肺内CD11b+DCs的比例明显下降(P<0.05),而CD103+DCs的比例则明显上升(P<0.05)。KO-AS组肺内DCs总数与正常对照组相比显著升高(P<0.05),但是与KO-AS组比较,KO-AA组治疗后DCs总数和CD103+DCs、CD11b+DCs的比例均无显著变化。结论:1.CC10基因敲除能增强哮喘模型的气道炎症反应,CC10具有抑制哮喘炎症的作用。2.针刺能显著抑制WT与CC10-/-哮喘模型气道高反应性和气道炎症反应,针刺的抗哮喘效应不完全依赖于CC10蛋白,可能涉及其他多种分子靶点,但是CC10基因敲除在一定程度上降低了针刺对哮喘炎症的抑制作用。3.针刺可能通过调节哮喘DCs的数量与表型,抑制Th2细胞对外源性抗原的反应强度,CC10基因敲除后哮喘炎症增强可能与肺内DCs聚集有关,为进一步开展基于DCs的针刺抗哮喘作用机制研究提供了科学基础。