【摘 要】
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目的:观察解毒通络生津方对NOD/Ltj小鼠PD-1/PD-L1信号通路的调控,探讨解毒通络生津方对干燥综合征的治疗作用及相关分子免疫学机制,为其在临床上的应用提供理论依据。方法:将24只8周龄雌性NOD/Ltj小鼠随机分为3组,即模型对照组、解毒通络生津方组、羟氯喹组,每组8只。另8只8周龄雌性ICR小鼠作为正常对照组。12周龄时开始干预,解毒通络生津方组按照每天24.4g/kg药量灌胃,羟氯喹
【基金项目】
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国家自然科学基金《基于PD-1/PD-L1通路对Treg细胞的调控探讨解毒通络生津方治疗干燥综合征的作用机制》项目编号:81573925；
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目的:观察解毒通络生津方对NOD/Ltj小鼠PD-1/PD-L1信号通路的调控,探讨解毒通络生津方对干燥综合征的治疗作用及相关分子免疫学机制,为其在临床上的应用提供理论依据。方法:将24只8周龄雌性NOD/Ltj小鼠随机分为3组,即模型对照组、解毒通络生津方组、羟氯喹组,每组8只。另8只8周龄雌性ICR小鼠作为正常对照组。12周龄时开始干预,解毒通络生津方组按照每天24.4g/kg药量灌胃,羟氯喹组给予每天40 mg/kg含药量灌胃,正常组与模型组给予同等剂量的生理盐水定时灌胃。实验期间记录各组小鼠第9、12、16、20周龄时的日均饮水量和唾液流量。干预8周后,小鼠统一麻醉下进行心脏采血、摘取颌下腺和脾脏。HE染色观察小鼠颌下腺中炎症细胞浸润情况;免疫组化观察小鼠颌下腺AQP5的表达与分布;ELISA检测小鼠血清IgG、IgA、IgM的表达水平;流式细胞仪检测小鼠CD4+CD25+Foxp3+PD-1+Treg细胞频数;Western Blot检测小鼠CD4+T细胞中PD-1、PD-L1、Foxp3及p-PI3K、p-AKT、IL-2蛋白的表达。结果:（1）饮水量统计显示:自12周起模型组小鼠日均饮水量上升,与正常组相比（P＜0.001）,经治疗后小鼠饮水量有下降趋势且解毒通络生津方组较羟氯喹组显著;唾液流量检测结果显示:自12周起模型组小鼠的唾液流量明显下降,与正常组相比（P＜0.001）,经解毒通络生津方和羟氯喹治疗后小鼠唾液流量升高,与模型组相比（P＜0.05）;HE染色结果显示:模型组小鼠颌下腺炎症细胞浸润明显,与正常组相比（P＜0.001）;经治疗后,炎症细胞浸润程度有明显改善,且解毒通络生津方较羟氯喹组显著,与模型组相比（P＜0.001）;免疫组化结果显示:模型组小鼠颌下腺AQP5表达率下降,与正常组相比（P＜0.001）,经治疗后AQP5的表达率明显升高,且解毒通络生津方较羟氯喹组显著,与模型组比较（P＜0.001）;ELISA实验结果显示,模型组小鼠血清IgG、IgM、IgA的表达升高,与正常组相比（P＜0.05）,经治疗后IgG、IgM、IgA的表达明显下降,且解毒通络生津方组较羟氯喹组显著,与模型组相比（P＜0.01）。（2）流式细胞分析显示:模型组小鼠CD4+CD25+Foxp3+PD-1+Treg细胞频数降低,与正常组相比（P＜0.001）,经药物治疗后CD4+CD25+Foxp3+PD-1+Treg细胞频数明显的升高,且解毒通络生津方要比羟氯喹更为显著,与模型组相比（P＜0.05）;Western Blot实验结果显示:模型组小鼠CD4+T细胞中PD-1、PD-L1、Foxp3的表达下降,与正常组相比（P＜0.001）,在药物治疗后PD-1、PD-L1、Foxp3的表达升高,且解毒通络生津方较羟氯喹显著,与模型对照组相比（P＜0.001）;模型组小鼠CD4+T细胞中p-PI3K、p-AKT、IL-2的表达升高,与正常组相比（P＜0.001）,药物治疗后p-PI3K、p-AKT、IL-2的表达明显下降,且解毒通络生津方较羟氯喹显著,与模型组相比（P＜0.001）。结论:1.解毒通络生津方能显著增加NOD/Ltj小鼠的唾液流量,降低小鼠日均饮水量,保护腺体分泌功能;2.解毒通络生津方能有效抑制NOD/Ltj小鼠颌下腺淋巴细胞浸润,改善组织病理损伤,并增加AQP5的表达和分布;3.解毒通络生津方能降低NOD/Ltj小鼠血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的表达水平;4.解毒通络生津方能促进NOD/Ltj小鼠CD4+T细胞上PD-1/PD-L1分子间相互作用,降低PI3K/AKt通路的磷酸化水平,诱导效应性T细胞功能耗竭,减少促炎因子IL-2的产生;5.解毒通络生津方可通过PD-1/PD-L1信号轴,促进NOD/Ltj小鼠Treg细胞分化,上调Foxp3的表达;6.PD-1/PD-L1信号通路可能是解毒通络生津方治疗SS的一个作用靶点。
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