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研究目的:近年来,肿瘤免疫治疗在基础和临床实践中均取得了引人瞩目的成果,目前肿瘤免疫治疗中取得代表性成果的细胞治疗方法主要包括细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTLs）、肿瘤浸润性淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes,TILs）、嵌合抗原修饰的T淋巴细胞（Chimeric Antigen Receptor-Modified T cell,CAR-T）以及T细胞受体修饰的T淋巴细胞（T Cell Receptor Modified T cell,TCR-T）。此外,免疫检查点抑制剂:程序性细胞死亡蛋白-1（Programmed cell death protein-1,PD-1）/程序性细胞死亡蛋白-1的配体（Ligand of programmed cell death protein-1,PD-L1）单抗和细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（Cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）单抗也相继获批用于临床抗肿瘤治疗,并且在恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤治疗中取得喜人的疗效。然而,对于包括胃癌（Gastric cancer,GC）在内的大多数恶性实体肿瘤患者而言,免疫治疗的获益有限。效应免疫细胞能否有效穿透坚实致密的肿瘤外基质到达肿瘤实质内部从而发挥抗肿瘤作用,是过继性效应免疫细胞回输疗法以及免疫检查点抑制剂疗法能否取得疗效的最关键影响因素。因此,提高效应免疫细胞在肿瘤组织内部的浸润,是促进免疫治疗发挥疗效的重要措施之一。iRGD（Tumor penetrating peptide,internalizing RGD）是一种小分子肿瘤靶向穿透肽,可以通过与肿瘤细胞表面的神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1,NRP-1）、整合素受体ανβ3/ανβ5结合,实现将效应免疫细胞或者小分子药物递送至肿瘤组织内部的目的。胃癌是世界范围内发病率及死亡率均位居前列的恶性实体肿瘤之一,其缺乏表达率高、特异性强的优势抗原靶点,为针对胃癌的靶向及免疫治疗增加了挑战性。KRAS扩增是一种促癌突变,其在胃癌中具有较高的突变频率,依据对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）的数据进行分析后的结果,KRAS扩增占染色体不稳定（Chromosomal Instability,CIN）类型胃癌总数的13%,可作为胃癌治疗的可选择靶点之一。同时,对TCGA数据库中KRAS扩增的胃癌进行预后分析,发现KRAS扩增胃癌的预后较无KRAS扩增胃癌显著较差,针对KRAS扩增胃癌研究,有深远的科学及临床意义。MEK抑制剂（MEK inhibitor,MEKi）可抑制因RAS-RAF-MEK-ERK信号通路过度激活而引起的肿瘤增殖,在KRAS突变肿瘤治疗中取得较好的效果,但是在KRAS扩增胃癌中显示出较低的药物敏感性。有研究显示,MEKi与SHP2、SOS等位点的抑制剂联用,可以显示出对KRAS扩增胃癌细胞较强的增殖抑制,说明MEKi在KRAS扩增胃癌的治疗中是有价值的。iRGD的修饰可以增加T细胞的穿透能力,增强免疫治疗的效力;KRAS扩增在胃癌中占有较大比例,但是既往相关研究较少,目前尚无针对该类型胃癌的免疫治疗有效方案;因此,本课题主要探究了MEKi与iRGD修饰的T细胞的联合在KRAS扩增胃癌中的疗效及相关机制,本课题主要从以下几个方面开展研究:（1）初步探究MEKi在免疫调控中的作用,并且进一步在体外、体内实验中验证T细胞免疫治疗联合MEKi在KRAS扩增胃癌中的疗效;（2）为了增加效应T细胞向肿瘤内部的浸润,将iRGD插件修饰在T细胞表面,之后以KRAS扩增的胃癌为研究模型,进行了iRGD修饰的T细胞联合MEKi的体内外疗效评价;（3）对联合治疗的机制进行初步的探究,为可能的临床应用提供科学依据。研究方法:1、MEKi的免疫调控作用探究:通过CCK8法检测MEKi对3种不同KRAS状态胃癌肿瘤细胞系的增殖抑制作用,来明确不同细胞对MEKi的药物敏感性,3株胃癌肿瘤细胞系分别为AGS（KRAS突变）、MKN45（KRAS野生型）以及KE39（KRAS扩增）。检测MEKi对T细胞表面PD-1、LAG3、CTLA4、TIM-3、FOXP3分子表达水平的影响,同时检测药物对肿瘤细胞表面PD-L1表达水平的影响、检测药物对肿瘤细胞分泌趋化因子能力的影响,包括:CXCL8、CCL5、CXCL9、CCL2、CXCL10。同时在3D胃癌细胞球模型上检测MEKi对T细胞穿透及抗肿瘤杀伤作用的影响。2、探究MEKi联合活化的T细胞在KRAS扩增胃癌中的抗肿瘤效果:在体外杀伤实验及裸鼠移植瘤动物模型中探究MEKi与T细胞的联合在KRAS扩增胃癌中是否能有协同抗肿瘤作用。3、构建iRGD修饰的T细胞:通过质谱分析法检测DSPE-PEG-iRGD的合成效率,之后将合成好的DSPE-PEG-iRGD通过物理脂质嵌插的方法修饰到T细胞表面,通过流式细胞术检测连接效率、饱和度、稳定性,对T细胞杀伤能力、分泌细胞因子能力的影响等。在胃癌3D细胞球上验证iRGD修饰的T细胞具有较强的肿瘤穿透能力。4、探究iRGD修饰的T细胞联合MEKi在KRAS扩增胃癌中的抗肿瘤效果:构建KRAS扩增胃癌皮下瘤模型,通过体内抑瘤实验及观察裸鼠生存时间评估联合治疗的体内抗肿瘤作用及安全性。机制研究方面,通过免疫组化、免疫荧光的方法评估T细胞的浸润程度以及抑制性分子TIM-3表达的变化水平。研究结果:药敏实验显示MEKi对KRAS突变的胃癌细胞较为敏感,而对KRAS扩增的胃癌细胞不敏感。MEKi的免疫调控作用探究中发现,MEKi可以下调活化T细胞表面的抑制性TIM-3分子,改善T细胞功能。同时,MEKi可以下调肿瘤细胞表面PD-L1分子的表达,减少肿瘤细胞对CXCL8细胞因子的分泌,改善免疫抑制性微环境。在3D胃癌细胞球模型中发现MEKi可以增加T细胞向胃癌肿瘤细胞球中的穿透及杀伤作用。动物实验中也证明活化的T细胞联合MEKi可以显著增加抑瘤效果。为了增加T细胞向肿瘤内部的浸润,构建iRGD修饰的T细胞,通过流式检测,结果证实采用聚乙二醇-磷脂衍生物可以成功将iRGD修饰在T淋巴细胞表面,这种修饰模式持久稳定并且对T细胞的活力、表型、功能均无明显影响。iRGD修饰的活化T细胞联合MEKi在KRAS扩增胃癌体内、体外抗肿瘤效果评估均验证该联合疗法的有效性,体外实验显示联合治疗可以提高杀伤效率,体内实验显示联合治疗能明显抑制肿瘤增长,延长小鼠生存期,且不损伤重要脏器,安全性良好。在相关机制研究中,证实MEKi可以增加T细胞的浸润能力,减少免疫抑制性分子TIM-3的表达,有助于改善抑制性肿瘤微环境,提高免疫治疗的疗效。研究结论:本实验初步探究了MEKi对于改善免疫微环境中的作用,验证了活化T细胞联合MEKi在KRAS扩增类型胃癌治疗中的价值,iRGD的修饰可以进一步提高抑瘤效率,增加T细胞浸润,该iRGD修饰的T细胞联合MEKi的疗法展现出较好的临床应用潜力,为KRAS扩增类型胃癌提供了新的治疗策略和手段。