乳腺癌（breast cancer）严重危害女性健康,乳腺癌细胞一旦发生脑转移,患者生活质量及生存时间显著降低,乳腺癌脑转移的分子机制目前尚不清楚。筛选及鉴定乳腺癌细胞脑转移相关分子,探究乳腺癌脑转移的分子机制,发现并确定脑转移性乳腺癌诊断与治疗的新靶标具有重要意义。本实验室前期通过噬菌体展示肽库筛选技术,获得乳腺癌脑转移细胞系231-BR靶向多肽—BRBP1肽（专利号:ZL201210538671.4）。荷瘤鼠模型体内实验证实该肽与231-BR细胞呈特异性结合;乳腺癌临床标本检测结果显示,该肽与人乳腺浸润性导管癌原发灶组织标本结合,并且与转移灶肿瘤细胞结合更强。BRBP1肽与乳腺癌细胞系以及临床标本的结合特异性,提示该肽可能结合高转移潜能乳腺癌细胞表面的脑转移相关分子。为筛选231-BR细胞表面与BRBP1肽结合的靶分子,本实验室前期将BRBP1肽与免疫球蛋白G（immunoglobulin G,Ig G）Fc段融合成肽体,与231-BR细胞总蛋白免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）（Fc与231-BR细胞总蛋白Co-IP作为对照）,同时将生物素化BRBP1肽与231-BR细胞膜蛋白Co-IP（生物素化BRBP1肽与MDA-MB-231、MCF-7细胞膜蛋白Co-IP作为对照）。将Co-IP产物银染后,选取实验组Co-IP产物泳道的特异性条带进行质谱分析及筛选鉴定,但均未获得BRBP1肽结合靶分子。因此,本研究进一步探究BRBP1肽结合靶分子。1.乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合候选靶分子的鉴定目的:据文献报道,膜突蛋白（moesin,MSN）和肝配蛋白B1（ephrin-B1,EFNB1）在乳腺癌脑转移细胞系231-BR中表达高于亲代细胞系MDA-MB-231,且与细胞转移侵袭有关,有可能是BRBP1肽结合靶分子。此外,本实验室前期通过筛选还获得候选靶分子葡萄球菌核酸酶结构域1（staphylococcal nuclease domain-containing 1,SND1）。因此,本章进一步鉴定MSN、EFNB1、SND1这三个候选靶分子。方法:分别基于MSN和EFNB1基因构建过表达质粒并转染至MCF-7细胞过表达MSN、EFNB1;基于SND1基因合成si RNA-SND1,转染至231-BR细胞干扰SND1表达;流式细胞术鉴定上述细胞与BRBP1肽的结合情况。结果:成功构建pc DNA3.1（-）-MSN与pc DNA3.1（-）-EFNB1质粒并在MCF-7细胞中过表达,但MSN、EFNB1表达上调的MCF-7细胞所结合BRBP1肽均无增加。si RNA-SND1成功干扰231-BR细胞中SND1的表达,但SND1表达下调的231-BR细胞所结合BRBP1肽未减少。结论:MSN、EFNB1、SND1均不是BRBP1肽结合靶分子,后续需要采用新的方法,重新筛选候选靶分子。2.乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1结合靶分子的筛选目的:尝试通过截短或者环化BRBP1多肽以提高其亲和力;基于Co-IP实验思路,分别利用生物素修饰多肽BRBP1-biotin以及BRBP1肽与人Ig G1 Fc段融合形成的BRBP1-Fc1肽体,进行靶分子筛选;流式分选出BRBP1肽高结合的231-BR细胞以及BRBP1肽低结合的231-BR细胞,转录组测序获得差异基因,并进一步分析筛选靶分子。方法:利用数据库预测BRBP1肽中与靶分子结合的关键氨基酸位点,据此设计BRBP1截短肽及环肽并鉴定改造后多肽与231-BR细胞的结合性能。BRBP1-biotin通过Pull-down捕获231-BR细胞蛋白（生物素修饰的无关多肽GK-biotin作为对照）,Western blot进一步鉴定捕获产物（一抗BRBP1-biotin,二抗Streptavidin-HRP）;基于Western blot结果提示BRBP1-biotin所捕获分子的分子量,质谱分析捕获产物银染后对应位置的条带。利用化学交联试剂DTSSP固定BRBP1-Fc1肽体与231-BR细胞间结合（Fc1与同一细胞交联作为对照）,提取细胞总蛋白并用Protein G磁珠纯化肽体（或Fc1）及其偶联产物,纯化产物进行银染,选择肽体纯化产物泳道出现的特异性条带进行质谱分析。利用流式细胞分选术,获得荧光信号最强（结合BRBP1-TAMRA最多）和信号最弱（结合BRBP1-TAMRA最少）的两组231-BR细胞,进行转录组测序,结合文献报道的转录组测序结果,分析筛选差异基因并进行鉴定。结果:两种截短线性肽与231-BR细胞结合性能均弱于BRBP1肽,C6及C9环肽与231-BR细胞不结合。Western blot结果显示BRBP1-biotin Pull-down产物泳道未出现不同于GK-biotin Pull-down产物泳道的特异性条带。成功改造载体并表达得到高纯度BRBP1-Fc1肽体,银染未检测到BRBP1-Fc1交联产物电泳后不同于Fc1交联产物的特异性条带。通过对转录组测序结果分析筛选,得到8个候选靶分子。结论:截短或环化BRBP1肽并未增加与231-BR细胞亲和力;BRBP1-biotin Pull down细胞蛋白,以及DTSSP交联BRBP1-Fc1与细胞的方法也未捕获到BRBP1肽的候选靶分子;转录组测序分析筛选得到8个候选分子。本实验室前期将髓系白血病细胞系HL-60作为原始细胞,通过药物浓度递增间歇诱导法,获得多药耐药（drug-resistance）细胞株HL-60R,利用噬菌体展示肽库消减筛选技术获得与HL-60R结合的5R5肽。该肽与白血病耐药细胞株以及髓系白血病患者骨髓涂片均具有良好结合特异性,提示该肽具有临床应用潜能,并且该肽结合的靶分子可能与白血病细胞耐药相关。本研究在初步鉴定5R5肽临床意义的基础上,构建了5R5-Fc肽体,期望通过多价展示5R5肽来增强肽体与HL-60R细胞亲合力,进而提高5R5-Fc肽体在白血病诊断与治疗中的应用价值,也为5R5肽靶分子的探究奠定实验基础。1.5R5肽临床意义的初步鉴定目的:收集临床髓系白血病患者骨髓涂片,鉴定5R5肽与骨髓涂片结合特异性,以初步判断该多肽的临床意义。方法:合成荧光修饰多肽5R5-TAMRA与对照肽GK-TAMRA,将每张骨髓涂片划分为两个区域,分别孵育5R5-TAMRA与GK-TAMRA,荧光显微镜观察5R5肽与骨髓涂片的结合。结果:5R5肽与四例正常人骨髓涂片均不结合,与16例髓系白血病患者骨髓涂片中,5例呈强阳性结合、9例呈阳性结合、2例不结合,结合阳性率为87.5%。结论:5R5肽与髓系白血病患者骨髓涂片呈特异性结合,初步提示5R5肽具有临床应用潜能,可继续扩大样本量进行验证及统计分析。2.5R5-Fc1二价肽体真核表达质粒载体构建、表达与鉴定目的:免疫球蛋白Ig G1 Fc结构域能够介导较强的免疫效应功能,是开发肽体类药物的良好选择。本节利用Ig G1 Fc与5R5肽融合,构建真核表达的二价5R5-Fc1肽体。方法:Eco RI和Nco I双酶切p FUSE-h Ig G1-Fc得到线性化载体,并合成带有Eco RI和Nco I酶切位点以及Gly-GLy-Gly-Ser linker的5R5肽基因片段,T4连接酶将线性化载体与基因片段连接;将真核表达质粒载体p FUSE-h Ig G1-Fc-5R5转染至293T细胞进行表达,Western blot检测培养上清中5R5-Fc1肽体,流式细胞术鉴定其结合性能。结果:成功构建真核表达质粒载体p FUSE-h Ig G1-Fc-5R5并表达5R5-Fc1肽体,该肽体与HL-60R细胞间结合并不显著高于Fc1与HL-60R细胞间结合。结论:因耐药细胞株HL-60R表达FcγR,Fc1与FcγR间亲合力高于5R5肽与HL-60R细胞间亲合力,导致5R5-Fc1肽体通过其Fc端“倒立”结合至耐药细胞株,无法实现5R5肽依赖性的特异性结合。后续选择利用与FcγR亲和力较低的Ig G4 Fc构建肽体,在5R5-Fc肽体与HL-60R细胞间实现5R5肽依赖性的特异性结合。3.（5R5）2-Fc4四价肽体原核表达质粒载体构建、表达与鉴定目的:选取与FcγR亲和力较低的Ig G4 Fc,并延长多肽与Fc之间linker长度,将两个重复拷贝的5R5多肽串联至Ig G4 Fc,构建四价（5R5）2-Fc4肽体,预期在该肽体与HL-60R细胞间,实现5R5肽依赖性的特异性结合。方法:构建肽体的原核表达质粒载体p ET-16b-（5R5）2-Fc4,转化至BL21,原核表达四价（5R5）2-Fc4肽体,考马斯亮蓝染色鉴定肽体表达,流式细胞术鉴定其结合性能。结果:成功构建原核表达质粒载体p ET-16b-（5R5）2-Fc4并表达四价（5R5）2-Fc4肽体。（5R5）2-Fc4肽体与HL-60R细胞结合并不显著高于Fc4与HL-60R细胞间结合。结论:5R5肽与其靶分子亲和力仍然弱于Fc4与FcγR亲和力,导致（5R5）2-Fc4肽体仍然由于Fc端与HL-60R细胞表面FcγR相互作用而“倒立”结合至细胞,无法依赖于5R5肽而特异性结合。后续实验中,可以考虑改造5R5肽提高亲合力或者突变Fc,消除其与FcγR结合能力,构建依赖于5R5肽与耐药细胞株HL-60R特异性结合的肽体。