论文部分内容阅读
目的:四妙勇安汤由金银花、玄参、当归、甘草四味药组成,具有清热解毒、活血止痛的功效,是治疗热毒炽盛之脱疽的经典名方,现代临床上常用于治疗动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）等相关疾病,具有明显的抑制炎症反应,稳定斑块,延缓AS进展的作用。但四妙勇安汤化学成分复杂,对体内化学成分及生物转化过程研究较少,复方成分的体内暴露情况及治疗AS的药效物质尚不清楚。因此,本研究以正常C57BL/6J小鼠和采用右侧颈动脉套管术（perivascular carotid collarplacement,PCCP）联合高脂喂养诱导的ApoE-/-小鼠AS模型为研究对象,探究四妙勇安汤在小鼠体内的代谢、药代动力学以及正常和模型药动学差异原因。方法:一、采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS）联用技术,分析鉴定四妙勇安汤给予正常和AS模型小鼠灌胃给药7天后的血浆和尿液中的原型成分及代谢产物。二、建立超高效液相串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive HF-X）联用技术同时测定血浆中哈巴苷、绿原酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、安格洛苷C、甘草苷和异甘草素含量的分析方法,并将该方法应用于四妙勇安汤多组分在正常和AS模型小鼠体内的药动学比较研究。三、采用UHPLC-Q Exactive HF-X联用技术测定四妙勇安汤7个成分哈巴苷、绿原酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、安格洛苷C、甘草苷和异甘草素在正常小鼠和AS模型小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠和大肠中的含量,开展组织分布研究。四、针对四妙勇安汤在正常和AS模型小鼠中7个活性成分的体内代谢、药动学和组织分布差异,从细胞色素P450（CYP450）酶的角度解释可能造成差异的原因。钙盐沉淀法自制小鼠肝微粒体,Cocktail鸡尾酒探针法结合UHPLC-Q Exactive HF-X,建立同时测定小鼠肝微粒体中五种CYP450同工酶（CYP1A2、2B6、3C19、2E1和3A4）探针代谢产物（对乙酰氨基酚、羟基安非他酮、5-羟基奥美拉唑、6-羟基氯唑沙宗、6β-羟基睾酮）含量的方法,方法验证后,应用于正常小鼠、AS小鼠和四妙勇安汤给药后肝脏CYP450酶活性的体外比较研究。结果:一、四妙勇安汤在小鼠体内的主要成分包括环烯醚萜苷、黄酮、有机酸、苯丙素类等原型成分25种,相关代谢产物44种,以及未知化合物4种;代谢途径主要以Ⅰ相（氧化、还原、水解等）、Ⅱ相（甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等）为主;疾病状态下的代谢途径与正常存在差异,大多数经过Ⅰ相代谢反应后,再经过Ⅱ相结合后排泄。二、四妙勇安汤7个活性成分（哈巴苷、绿原酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、安格洛苷C、甘草苷和异甘草素）在小鼠血浆的定量方法,其专属性、线性关系、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性均在可接受标准范围内。与正常组相比,AS模型小鼠中哈巴苷、绿原酸和异甘草素的某些药动学参数有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）:哈巴苷 AUC0-t和 AUC0-∞分别为 11075.09±2132.38 和 16221.95 ± 5622.42 ng·mL-1·h、CLz/F 为 2.45±0.87 L/h/mg;绿原酸t1/2 为 21.59 ± 9.16 h、AUC0-∞为 2637.51±322.54 ng·mL-1·h、CLz/F 为 13.49± 1.81 L/h/mg;异甘草素的 AUC0-t和 AUC0-∞参数分别为 502.25±165.65 和 653.68±251.34 ng·mL-1·h、CLz/F 为 62.16±23.35 L/h/mg。三、四妙勇安汤的7个成分（哈巴苷、绿原酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、安格洛苷C、甘草苷和异甘草素）在小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠和大肠的定量方法,其专属性、线性关系、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性均在可接受标准范围内。结果表明:哈巴苷、绿原酸、獐牙菜苷、安格洛苷C在9种组织中均有分布;獐牙菜苦苷在脑中未检出,其他组织均有分布;甘草苷只在胃、小肠和大肠中存在;异甘草素在脑、胃、小肠和大肠中有分布。与正常组相比,在AS模型小鼠组织中,哈巴苷、绿原酸、獐牙菜苷和安格洛苷C在心的含量明显增高（P＜0.01）。绿原酸在肝的分布中含量显著增加（P＜0.05）;绿原酸、獐牙菜苷和安格洛苷C在脾的分布中含量明显增高（P＜0.01;P＜0.05）,獐牙菜苦苷和獐牙菜苷在肺中的含量显著增加（P＜0.05;P＜0.01）,獐牙菜苷在肾中的含量显著增加（P＜0.01）。四、Cocktail鸡尾酒探针法结合UHPLC-Q Exactive HF-X 比较P450酶的活性,与正常组相比,模型组的CYP3A4活性显著降低（P＜0.01）;正常给药组与正常组相比,CYP2B6、2E1、2C19酶活性明显升高（P＜0.01）;模型给药组与模型组相比,CYP2E1、2C19、3A4的酶活性明显增强（P＜0.05或P＜0.01）。结论:明确了四妙勇安汤在小鼠体内暴露的主要成分及代谢产物,初步确定了不同类型成分的代谢规律。正常与AS小鼠的药动学参数差异可能归因于AS状态下CYP450酶活性、胃肠道微生物群和非特异性药物转运体的变化。四妙勇安汤多组分通过多靶点发挥治疗AS作用,主要靶器官为心、肝、脾、肺、肾,并提示AS病理状态对这些四妙勇安汤成分的组织分布规律造成了影响,推测可能是由于疾病状态下相关代谢酶、转运体活性或蛋白表达发生了改变。四妙勇安汤对CYP2B6、2E1和2C19有诱导作用,会加快药物代谢;另外模型下CYP3A4活性的降低可能是AS的高脂炎症的病理状态导致肝脏损伤,进而降低其活性,同时模型给药组3A4酶活性升高,表明四妙勇安汤具有回调CYP3A4酶活性的药理作用。本研究通过比较四妙勇安汤在正常小鼠与AS模型小鼠中的体内代谢规律、药动学特征、组织分布特点及对CYP450酶活性的影响,为初步阐明四妙勇安汤治疗AS的药效物质提供了实验依据,对其治疗AS的作用机理具有参考价值。