研究背景与目的:尤文肉瘤（ES,Ewing Sarcoma）常被认为是间充质干细胞起源的原发性骨与软组织恶性肿瘤,是儿童与青少年中第二常见的骨源性恶性肿瘤,发病率仅次于骨肉瘤,约每150万人1例。尤文肉瘤可发病于身体任何部位,80%发生于骨,最常见于骨盆和长骨近端;骨外尤文肉瘤更多出现在成人群体,主要发病部位位于椎旁和胸椎软组织。尤文肉瘤的治疗包括手术、局部放疗和化疗等多学科综合治疗,随着治疗水平的不断进步,针对早期、局限性的尤文肉瘤治疗逐渐成熟,患者的5年生存率保持在70%以上,然而,约百分之20%-30%的患者在确诊时伴有远处转移,这类患者的5年生存率不足30%,传统的治疗方式很难在转移患者中取得理想效果。探索尤文肉瘤发生发展的潜在分子机制,识别有效的靶向治疗和预后预测的生物标志物,会为克服当前的临床困难提供更多机会。在肿瘤的发生进展中,肿瘤细胞生长和生存所依赖的微环境起着至关重要的作用。肿瘤部分由一个复杂的肿瘤微环境（TME,Tumor micro-environment）构成,不仅包括肿瘤细胞,还包括驻留的成纤维细胞（肿瘤相关成纤维细胞;CAFs,Cancer-associated Fibroblasts）和巨噬细胞,远处募集的免疫浸润细胞如髓系细胞和淋巴细胞、骨髓来源的细胞（BMDCs,Bone Marrow-derived Cells）如内皮祖细胞和造血祖细胞等。这些细胞可以分泌产生各种细胞因子、趋化因子、生长因子和新生血管,调节肿瘤的发生发展。因此,通过分析肿瘤微环境的异质性和复杂性,可以识别不同肿瘤的免疫特性,提高对免疫治疗反应的指导和预测能力,并有利于寻找新的治疗靶点。本课题拟从肿瘤微环境为切入点,分析评估尤文肉瘤的免疫特性,探索调控尤文肉瘤发生进展的肿瘤微环境相关基因及潜在机制,为尤文肉瘤的诊断与治疗提供新的理论依据。第一部分基于尤文肉瘤肿瘤微环境特征的预后分析与基因筛选研究方法:我们通过整合分析基因表达综合数据库（GEO,Gene Expression Omnibus）中的相关尤文肉瘤m RNA基因芯片数据,利用ESTIMATE算法（Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumour tissues using Expression data）对芯片样本进行肿瘤纯度、基质细胞存在水平和免疫细胞浸润水平进行评分。结合计算得出的基质评分和免疫评分,我们进而以加权基因共表达网络分析算法（WGCNA,Weighted correlation network analysis）探索与尤文肉瘤肿瘤微环境（ES-TME）相关的基因集,我们对基因集中的基因进行了单因素Cox生存分析和Lasso回归分析,筛选与预后相关的候选基因并构建预后模型（ES Score）来评估其对ES的临床评估效果。我们利用国际肿瘤基因组协作组数据库（ICGC,International Cancer Genome Consortium）中尤文肉瘤的测序数据检验预后模型的效益和候选基因的可靠性以得出影响预后的关键ES-TME基因。最后我们基于美国肿瘤患者数据库（TCGA,The Cancer Genome Atlas）检测该关键基因在泛癌中的表达情况,初步评价其在恶性肿瘤中的作用,并分析验证其潜在的免疫调节功能。研究结果:通过生物信息学分析,我们发现通过ESTIMATE算法赋值的免疫评分和基质评分都作为预后危险因素,与肿瘤纯度显著负相关。基于免疫微环境评分进行预后相关分析的进一步筛选,得出ARAP3、PODXL、CCL18和CTSC为尤文肉瘤预后相关的ES-TME候选基因并构建预后模型。模型评价和生存分析提示ARAP3在GEO基因芯片和ICGC测序数据中均作为关键的不良预后因子影响患者的总体生存率（OS,Overall Survival）和无事件生存率（EFS,Event-free Survival）。结合文献检索,我们认为ARAP3可能在尤文肉瘤的发生发展中具有重要的调控作用。TCGA泛癌表达谱分析提示,ARAP3在不同肿瘤中的表达具有差异性,在乳腺癌、宫颈癌、肺癌等肿瘤中显著低表达;在胆管癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤中显著高表达,提示ARAP3在不同肿瘤中的作用和表型可能具有较大异质性。免疫相关分析表明ARAP3参与到诸多免疫活动,可能是潜在的免疫调节靶点。结论:尤文肉瘤的免疫微环境在疾病的进展与预后中起重要调节作用,通过对尤文肉瘤基因芯片数据的免疫和基质评分及预后相关分析,发现ARAP3可以作为尤文肉瘤潜在的作用靶点。第二部分ARAP3对尤文肉瘤恶性生物学行为的作用研究方法:收集尤文肉瘤细胞系和临床患者的组织标本,利用qRT-PCR、Western Blot和IHC染色技术明确ARAP3的表达谱。进一步利用RNA干扰技术（RNAi,RNA interference）在尤文肉瘤细胞系中敲低了ARAP3的表达。通过克隆形成实验、CCK8实验、Transwell实验、细胞凋亡实验和细胞周期实验等在体外探究ARAP3对尤文肉瘤恶性生物学行为的调控作用。最后,我们收集对照和敲低ARAP3尤文肉瘤细胞的RNA进行转录组测序（RNA-seq）,通过通路分析,并结合实验探究ARAP3调控尤文肉瘤恶性生物学行为的潜在机制。研究结果:临床患者的组织标本分析发现,ARAP3在尤文肉瘤的表达显著高于瘤旁正常组织。ARAP3在尤文肉瘤细胞系SK-NM-C、SK-ES-1、A673和RD-ES中的表达显著高于正常人骨髓来源的间充质干细胞（h BMSC,human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cell）。我们设计小干扰RNA（si RNA,small interfering RNA）在RD-ES和SK-ES-1细胞中敲低ARAP3的表达,体外实验发现敲低ARAP3后明显抑制了肿瘤细胞的增殖,诱导了肿瘤细胞的凋亡;肿瘤细胞的迁移和侵袭能力也明显减弱。RNA-seq和PCR检测证实了ARAP3敲低后p53信号通路的激活。结论:ARAP3在尤文肉瘤中高表达,敲低ARAP3可激活p53信号通路从而抑制尤文肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进尤文肉瘤细胞的凋亡。第三部分ARAP3对微环境的调控作用和潜在机制研究方法:我们对GEO和ICGC数据库中的尤文肉瘤测序数据进行了CIBERSORT（Cell-type Identification By Estimating Relative Subsets Of RNA Transcripts）和单样本基因富集分析（ss GSEA,single sample Gene Set Enrichment Analysis）两种方法评估尤文肉瘤患者中免疫细胞比例和尤文肉瘤患者间免疫细胞浸润差异,并进一步基于算法结果和临床样本的IHC染色分析ARAP3与尤文肉瘤巨噬细胞浸润程度的相关性。我们利用单核细胞招募实验明确ARAP3对小鼠骨髓来源的单核细胞（BMM,Bone Marrow-derived Monocyte）和小鼠巨噬细胞前体细胞RAW264.7趋化的影响。收集对照和敲低ARAP3尤文肉瘤细胞的条件培养基（CM,Conditioned Medium）,诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中加入不同CM,探究ARAP3对破骨细胞的影响。最后通过RNA-seq探究ARAP3影响尤文肉瘤微环境改造的潜在机制。研究结果:CIBERSORT分析发现尤文肉瘤患者免疫细胞中巨噬细胞的浸润程度较高,M2型巨噬细胞占比较大;ss GSEA分析发现ARAP3表达与巨噬细胞浸润显著正相关。组织芯片IHC染色进一步证明尤文肉瘤组织中ARAP3表达与巨噬细胞标记基因CD68表达呈正相关。体外细胞实验证实,敲低ARAP3抑制了尤文肉瘤细胞对BMM和RAW264.7细胞的招募作用。通过破骨细胞分化实验,我们发现敲低ARAP3肿瘤细胞的条件培养基可以抑制破骨细胞的分化。RNA-seq、q RT-PCR和WB检测发现,ARAP3敲低后IL1B的表达显著降低这可能是ARAP3在微环境中作用的关键因子。结论:ARAP3可能通过调控肿瘤细胞分泌IL1B来影响巨噬细胞招募和破骨细胞分化。