心血管病是我国人群的首位致死原因,尤其是缺血性心脏病。其中,急性心肌梗死（Myocardial infarction,MI）可诱导心肌细胞凋亡及炎症反应等一系列复杂的病理过程导致心肌功能性和结构性的损伤。临床上主要治疗策略多采用冠状动脉介入或溶栓等方法恢复冠状动脉的血流以减轻心肌组织的缺血性损伤。但血流的再灌注会导致比缺血本身更严重的心肌组织损伤,称为心肌缺血/再灌注（Myocardial ischemia/reperfusion,MI/R）损伤。因此,更加深入地研究急性心肌梗死及缺血/再灌注损伤的机制,寻找可有效改善MI及MI/R心肌损伤的药物进行干预治疗,是当前临床上的迫切需求。中药复方具有“多成分、多渠道、多靶点”协同作用的特点,在糖尿病、癌症、心脑血管疾病等复杂疾病的治疗中发挥了独特优势。以丹参、川芎、红花、降香为原料,采用中医理论整体观而制备的丹玉通脉颗粒,主活血祛瘀,理气止痛,能有效治疗心脑血管疾病,但对其心肌保护作用的机制研究尚不完善。代谢组学和网络药理学和中药在整体和系统特性上具有相似的性质,因此,在本课题中,我们遵从全面系统研究,动态辨证等全局性的特点,运用了一种新颖的整合策略:以代谢组学和网络药理学为基础并结合分子生物学,从系统生物学和整体整合的角度对疾病和中药治疗的分子机制做出科学的解释。研究目的:本研究首先明确丹玉通脉颗粒对大鼠心肌梗死及缺血再灌注的保护作用,采用分子生物学、代谢组学和网络药理学的综合策略,系统探究丹玉通脉颗粒的心肌保护作用机制,从而为丹玉通脉颗粒在心肌保护方面的临床应用提供理论依据,进一步开发该产品的药用价值,同时也为基于生物网络的中药复方作用机制研究做出了有益探索。研究方法与结果:1.在体外水平上使用H2O2诱导心肌细胞损伤模型,检测丹玉通脉颗粒预处理对H9c2心肌细胞的细胞活力、LDH漏出率以及细胞形态的影响,通过PCR初步探索丹玉通脉颗粒抗心肌细胞损伤可能的保护机制。体外结果表明,丹玉通脉颗粒显著改善H2O2诱导心肌细胞损伤,降低炎症相关基因（TNF-α、IL-1β和IL-6）的表达。2.在体内水平上,通过大鼠皮下注射异丙肾上腺素（Isoproterenol,ISO）建立体内MI模型。每组12只大鼠随机分成六组:对照组（Control）、模型组（MI）、丹玉通脉颗粒低、中、高剂量组（DL+MI、DM+MI、DH+MI）、木犀草素组（阳性对照,LUT+MI）。通过心重/胫骨长度比值、心电图、血清心肌酶及抗氧化物、心肌梗死面积、超声心动图等方法检测心肌损伤模型的建立及心功能的改善;HE、Masson及TUNEL染色检测心肌组织的病理学改变及细胞凋亡,验证丹玉通脉颗粒抗大鼠心肌梗死的作用。基于网络药理学方法,将药物靶点和MI疾病靶点比对分析以探寻丹玉通脉颗粒抗MI的核心靶点,并进行KEGG通路富集分析,进一步预测丹玉通脉颗粒多分子、多靶点和多途径抗心肌梗死的作用机制。采用UPLC-MS/MS代谢组学技术对各组大鼠心脏组织及血清样本进行代谢物的分析,采用SIMCA-P 14.1软件进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）,将符合P＜0.05,VIP＞1的差异代谢物通过Metaboanalyst网站进行代谢通路分析。基于网络药理学及代谢组学分析结果,进一步结合Western Blotting法检测炎性小体NLRP3、ASC、IL-1β、TNF-α、Caspase-1的表达,在动物水平评估丹玉通脉颗粒对MI大鼠的抗炎作用。体内实验结果表明,丹玉通脉颗粒能够减轻心肌细胞的凋亡,减小心肌梗死面积,改善MI损伤大鼠的心功能。网络药理学预测丹玉通脉颗粒可能通过激活AGE-RAGE、IL-17、NLRs、TNF等信号通路来发挥抗炎作用以调节MI的代谢紊乱。本次实验模型呈现组内聚集,组间分离的特点,且不存在过拟合现象。以P＜0.05,VIP＞1作为筛选条件,共鉴定得到与MI相关的血清差异代谢物43种、心脏组织差异代谢物44种。此外,还鉴定出被丹玉通脉颗粒回调的16种血清和18种心脏组织差异代谢物,主要参与了氨基酸代谢、脂类代谢和能量代谢等多途径发挥治疗心肌梗死的作用,其中丹玉通脉颗粒对于支链氨基酸（BCAA）代谢的调控作用最为显著。结合体外与网络药理学结果,并基于Western Blotting表明丹玉通脉颗粒通过调控BCAA代谢,抑制NLRP3炎性小体活性,增强机体抗炎作用,从而发挥抗心肌梗死作用。3.为了进一步确定BCAA代谢紊乱与炎症之间的关系,采用转录组学的方法分析BCAA代谢紊乱诱导的相关靶点和通路。结果表明,BCAA积累导致代谢紊乱会引起CSF1R、MVD、IDI1和ELOVL6等基因表达显著上调;通过调控HIF-1信号通路、Fox O信号通路、AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路、类固醇生物合成、脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等信号通路,实现其在先天免疫和炎症过程中发挥重要作用。其中ELOVL6、DHCR24等都促进了NLRP3依赖的炎性小体的激活。采用Western Blotting进一步验证了BCAA代谢紊乱通过激活NLRP3炎性小体,诱导心肌细胞炎症发生。4.在体内水平上,采用冠状动脉左前降支结扎术（Left anterior descending coronary artery,LAD）建立大鼠MI/R模型。每组12只大鼠随机分成五组:假手术组（Sham）、模型组（MI/R）、丹玉通脉颗粒低、中、高剂量组（DL+MI/R、DM+MI/R、DH+MI/R）。药效学验证及机制研究采用与MI模型相同的方法。体内实验结果表明,丹玉通脉颗粒可显著改善MI/R大鼠左心室收缩功能,减少心肌梗死面积、炎症细胞浸润和心肌细胞凋亡。网络药理学预测丹玉通脉颗粒抗MI/R损伤的核心蛋白靶点和通路,结果发现与心肌梗死模型相似,其主要通过HIF-1、TNF、NLRs、Toll样受体等信号通路发挥抗炎作用。代谢组学分析出与MI/R相关的血清差异代谢物29种、心脏组织差异代谢物49种。被丹玉通脉颗粒回调的17种血清和16种心脏组织差异代谢物,主要富集在氨基酸代谢、不饱和脂肪酸代谢、能量代谢等代谢通路中,其中丹玉通脉颗粒对于BCAA代谢的调控作用最为显著。丹玉通脉颗粒可通过增加BCAA代谢相关酶（BCAT2、BCKDH、PP2Cm）活性,显著改善代谢障碍引起的心肌BCAA蓄积,进而抑制NLRP3炎症小体的活化诱导的炎症反应,以减轻MI/R损伤。研究结论:本实验从体内体外水平首次证明丹玉通脉颗粒通过减少支链氨基酸的过度积累,抑制NLRP3炎性小体的活化,发挥抗心肌梗死及缺血/再灌注损伤的作用。