【摘 要】
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目的:国际癌症研究机构（International Agency for Reaserch on Cancer,IARC）将六价铬[hexavalent chromium,Cr（Ⅵ）]列为易引发肺癌的一级致癌物。本课题以六价铬恶性转化Beas-2B细胞[hexavalent chromium-transformed Beas-2B cells,Cr（Ⅵ）-Beas-2B]模型为基础,研究Cr（Ⅵ）
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目的:国际癌症研究机构（International Agency for Reaserch on Cancer,IARC）将六价铬[hexavalent chromium,Cr（Ⅵ）]列为易引发肺癌的一级致癌物。本课题以六价铬恶性转化Beas-2B细胞[hexavalent chromium-transformed Beas-2B cells,Cr（Ⅵ）-Beas-2B]模型为基础,研究Cr（Ⅵ）-Beas-2B源性外泌体[Cr（Ⅵ）-Beas-2B exosomes,Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex]对人正常肺上皮细胞（Bronchial Epithelium transformed with Ad12-SV40 2B,Beas-2B）的生物学作用及其分子机制。并探究外泌体中微小RNA（micro RNAs,miRNAs）作为预防六价铬致癌的分子治疗靶点和生物标志物的潜力。方法:1、Kit法提取Cr（Ⅵ）-Beas-2B与Beas-2B细胞上清中的外泌体Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex和Beas-2B-Ex,透射电镜、纳米粒径分析仪和Western blot联用鉴定外泌体。2、Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex及Beas-2B-Ex处理Beas-2B后,MTT实验、细胞克隆形成实验检测细胞活力和增殖能力。Western blot检测迁移、侵袭相关蛋白的表达;伤痕愈合实验、Transwell实验和免疫荧光实验检测细胞迁移能力。3、对Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex与Beas-2B-Ex中miRNA进行高通量测序,实时荧光定量PCR对候选miRNAs进行验证,生物信息学方法分析选定候选miRNAs。4、设计miR-146a-5p的mimics和inhibitor,转染Cr（Ⅵ）-Beas-2B细胞。继而提取转染后细胞上清中的外泌体,检测其中miR-146a-5p表达水平。并用外泌体处理Beas-2B细胞,检测对细胞增殖和迁移能力的影响,从而确定miR-146a-5p与外泌体发挥生物学功能相关。5、生物信息学方法预测miR-146a-5p的靶基因。双荧光素酶报告实验研究miR-146a-5p与靶基因的结合位点;在Beas-2B细胞中共转染靶基因si RNA与miR-146a-5p inhibitor后,通过MTT实验、细胞克隆形成实验探究miR-146a-5p靶向erb B4调控Beas-2B细胞活力和增殖能力;伤痕愈合实验、Transwell迁移实验检测miR-146a-5p靶向erb B4调控Beas-2B细胞迁移能力。结果:1.Kit法成功提取到Cr（Ⅵ）-Beas-2B与Beas-2B细胞上清中的外泌体,提取的外泌体样品形态机构、粒径分布及标志蛋白符合外泌体样品提取标准。根据增值曲线选定Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex处理浓度为100μg/m L。2、Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex能够促进Beas-2B细胞的增殖和迁移。3、高通量测序显示Beas-2B-Ex和Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex中丰度差异性的miRNAs共109种,其中48种在Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex中上调,61种下调。结合生物信息学方法分析及查阅文献,筛选与细胞的增殖及迁移能力相关的miRNA,确定miR-146a-5p为候选miRNA。4、Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex可转运miR-146a-5p进入Beas-2B细胞调控其增殖和迁移。5、在Beas-2B细胞中,miR-146a-5p靶向ErbB4抑制细胞的增殖及迁移能力。结论:Beas-2B-Ex和Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex中有多种丰度差异性miRNAs。Cr（Ⅵ）-Beas-2B-Ex可转运miR-146a-5p进入Beas-2B细胞并调控细胞的增殖和迁移。miR-146a-5p通过靶向ErbB4抑制Beas-2B细胞的增殖迁移能力。
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