研究背景和目的来源于植物的天然产物在预防和治疗疾病方面发挥着重要的作用。约有20%的中草药中含有具有抗癌、抗氧化等多种药理活性的黄酮类化合物,但是目前大多数黄酮类化合物还没有被开发成化学预防或治疗药物。造成黄酮类化合物无法有效应用的主要原因是这类化合物在体内极低的生物利用度(<10%)。II相代谢酶中的葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)引起的首过效应是其生物利用度低的重要原因之一。深入的研究这类化合物的UGT代谢机理,对黄酮类药物的开发有重要的意义。黄酮类化合物在体内处置过程中,外排转运蛋白和代谢酶共同起着重要作用。一方面化合物进入细胞内被代谢酶所代谢,代谢产物由于极性增高无法通过被动扩散排出细胞；另一方面外排转运蛋白(如P-gp、BCRP、 MRPs)能够将代谢产物外排出细胞,使代谢反应能够继续进行。抑制外排转运蛋白能够降低代谢产物在肠道和肝脏中的清除率,增加其在体循环中的累积量,造成药物毒性或是发挥更好的药理效果。综合考察代谢和外排两种因素对黄酮类化合物处置的影响,了解可以控制代谢的因素,对克服黄酮类化合物生物利用度屏障有重要的意义。本文选择了一种典型的黄酮类化合物木犀草素及两种碳苷黄酮作为模型化合物研究UGT代谢机理和外排转运蛋白对代谢的调控机制。木犀草素是一种多酚类黄酮化合物,在5、7、3’、4’位连接羟基,广泛存在于苔藓植物、蕨类植物、被子植物中,在日常饮食如胡萝卜、胡椒、芹菜、橄榄油中也大量存在。荭草苷和异荭草苷是以木犀草素为母体,6、8位通过碳碳键与葡萄糖相连的碳苷黄酮,广泛分布于淡竹叶、荭草、三色堇、金莲花等传统中药中。研究发现木犀草素、荭草苷和异荭草苷均具有保护心血管、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用。荭草苷和异荭草苷代谢研究极少,木犀草素在体内易被代谢成为葡萄糖醛酸代谢产物,被排出肠道而无法发挥药理作用。在我们的前期实验中发现木犀草素可被UGT代谢,代谢产物是外排转运蛋白BCRP的底物。因此深入的研究木犀草素UGT代谢机理和外排转运蛋白对其代谢的影响有利于我们全面的了解木犀草素在体内的处置情况,为增加其生物利用度,使其成为可供临床应用的制剂提供重要的理论依据。本文中我们通过体外药物代谢研究方法确定三种化合物的UGT代谢产物,探讨其UGT代谢机理。更重要的是通过考察在高表达UGT1A9的Hela细胞系中UGT1A9对木犀草素的代谢作用以及代谢产物的外排特征来探讨BCRP外排转运蛋白对UGT代谢的调控机制。实验方法与结果1.木犀草素、荭草苷和异荭草苷UGT代谢机理研究1.1木犀草素、荭草苷和异荭草苷UGT代谢产物的鉴定我们通过LC/MS/MS和HRMS对木犀草素、荭草苷和异荭草苷的葡萄糖醛酸代谢产物的结构进行了确证。结果显示荭草苷和异荭草苷在体外葡萄糖醛酸化代谢体系中分别产生了两个单葡萄糖醛酸结合产物。木犀草素在体外葡萄糖醛酸化代谢体系中可以产生六个葡萄糖醛酸代谢产物,其中三个为单葡萄糖醛酸代谢产物(M1,M2,M3),葡萄糖醛酸结合位点分别为7,4’,3’位,三个为双葡萄糖醛酸代谢产物(M5,M-2G,M6)。双葡萄醛酸代谢产物中的M-2G根据水解实验推测葡萄糖醛酸结合位点为4’,3’位。1.2UGT1A及UGT2B家族对木犀草素、荭草苷和异荭草苷的代谢研究为了阐明参与木犀草素、荭草苷和异荭草苷代谢的主要UGT isoform,我们运用重组人源化UGT亚酶与木犀草素、荭草苷和异荭草苷在10μM的浓度下进行孵育,计算每分钟每毫克蛋白代谢产物的生成速率。我们发现木犀草素在含有UGT isoform的二相反应体系中孵育30min只能检测到五个葡萄糖醛酸代谢产物,包括两个双葡萄糖醛酸代谢产物(M-2G,M6)和三个单葡萄糖醛酸代谢产物(M1,M2,M3)。对所有的酶亚型,代谢产物M1,M3的生成量最多,是最主要的葡萄糖醛酸代谢产物。UGT1A9是产生M-2G最多的酶亚型,UGT1A7次之,UGT1A1, UGT1A8, UGT1A10也能够代谢产生M-2G。UGT1A1是产生M6最多的酶亚型,UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A10, UGT2B7也能够代谢木犀草素生成M6。UGT1A9同时也参与了M1,M2和M3的生成,并且是生成代谢产物最多的一种亚酶。UGT2B家族对木犀草素的二相代谢的参与较少,UGT1A9, UGT1A1, UGT1A8是代谢木犀草素最重要的UGT亚酶。荭草苷在含有UGT isoform的二相反应体系检测到两个葡萄糖醛酸代谢产物(M1,M2)。UGT1A1, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A10参与了M1的生成,UGT1A8是代谢生成M2的重要酶亚型。异荭草苷在含有UGT isform的二相反应体系也检测到两个葡萄糖醛酸代谢产物(M1,M2)。其中UGT1A10是生成M1的主要酶亚型；UGT1A1和UGT1A10是生成M2的主要酶亚型。1.3人、大鼠肝微粒体对木犀草素、荭草苷、异荭草苷的酶代动力学研究为了能够能全面的了解木犀草素、荭草苷和异荭草苷的葡萄糖醛酸化代谢特征,我们使用了人、大鼠肝微粒体(Pooled human liver microsomes, HLM; Pool rat liver microsomes, RLM)反应体系来研究木犀草素、荭草苷和异荭草苷的酶代动力学特征。结果显示三种化合物的酶代动力学基本上符合Michaelis-Menten酶动学模型,无论是在HLM或RLM反应体系中,木犀草素的代谢速率都较其它两种化合物高。木犀草素产生7位葡萄糖醛酸代谢产物的Vmax最高。RLM对荭草苷的代谢速率较HLM快,而RLM和HLM代谢异荭草苷的Vmax相似。2.BCRP外排对木犀草素UGT代谢的调控机制研究2.1UGT1A9抑制实验和M-2G生成的时间依赖性考察为了研究UGT1A9是否在HLM对木犀草素的二相代谢中发挥着主要的作用,我们选择了UGT1A9的化学特异性抑制剂香芹酚,以孵育体系中不含香芹酚作为对照,通过对相同酶浓度的HLM和UGT1A9催化木犀草素产生代谢产物的减少量,来判断在HLM的代谢中UGT1A9是否起着主要的作用。结果显示200μM香芹酚使木犀草素在人肝微粒体孵育体系中代谢产物M-2G,M,M2,M3的产生量分别降低了27.8%,44.3%,17.6%,53.2%；200μM香芹酚使木犀草素在UGT1A9孵育体系中代谢产物M-2G,M1,M2,M3的产生量分别降低了68.9%,59.8%,34.6%,79.2%,香芹酚对UGT1A9和HLM代谢的抑制都呈浓度依赖性。UGT1A9在HLM代谢木犀草素中发挥着重要的作用。为了更好的了解UGT1A9代谢木犀草素生成M-2G的特征,我们考察了UGT1A9催化生成M-2G的时间依赖性。在木犀草素的浓度为10μM,UGT1A9的终浓度为0.265mg/ml时,M-2G的生成量随着时间的增加而增加,具有时间依赖性。2.2Hela-UGT1A9中UGT1A9的蛋白表达水平和Hela-UGT1A9cell lysate与UGT1A9的酶代动力学实验UDP-Glucuronosyltransferase (UGT)1A9-Overexpressing HeLa细胞系简称为Hela-UGT1A9,是一种经过转染可以稳定表达UGT1A9的Hela细胞系。这种细胞系同时高表达一种重要的外排转运蛋白BCRP,适用于研究外排转运蛋白和UGT代谢酶相互作用对药物处置的影响。蛋白免疫印迹法考察Hela-UGT1A9细胞系中UGT1A9的表达水平,结果显示该细胞系能够高表达UGT1A9。比较Hela-UGT1A9cell lysate和UGT1A9的酶代动力学特征来研究Hela-UGT1A9细胞系是否是适合于研究木犀草素UGT1A9代谢的模型。Cell lysate中UGT1A9的蛋白量经过校正后,Hela-UGT1A9cell lysate的酶代动力学参数Km,Vmax与UGT1A9相似。2.3木犀草素在Hela-UGT1A9细胞模型上的代谢与外排特征研究在本实验室的培养条件下,将Hela-UGT1A9种于六孔培养板中,经过3-4天培养,用于实验研究。采用此细胞模型分别考察了木犀草素1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM在Hela-UGT1A9细胞模型中的代谢外排特征。结果显示木犀草素在Hela-UGT1A9细胞模型上能迅速被代谢成葡萄糖醛酸代谢产物并排出细胞外。木犀草素三个单葡萄糖醛酸代谢产物M1,M2,M3的外排速率随着底物浓度增加而增加,当底物浓度为5,μM时,外排速率达到最大,当底物浓度超过20μM时外排速率有明显的下降。随着木犀草素底物浓度的增加,代谢产物细胞内的累积量呈现增加的趋势,代谢产物的细胞清除率CL有显著晶下降,Fmet值下降。2.4BCRP对木犀草素在Hela-UGT1A9细胞模型上UGT代谢的调控机制研究我们考察了BCRP专属性抑制剂Ko143对木犀草素在Hela-UGT1A9细胞上代谢和外排的影响。BCRP的浓度为5、10μM,木犀草素的浓度为2、10、40μM。Ko143能够显著降低木犀草素代谢产物的外排速率,并且使细胞内代谢产物的累积量增加。在木犀草素底物浓度为10μM,Ko143浓度为5μM时在细胞内检测到了双葡萄糖醛酸代谢产物(M-2G)。在木犀草素底物浓度为40,μM时,在不存在Ko143时细胞内也能够检测到双葡萄糖醛酸代谢产物,且随着Ko143浓度的增大,细胞内双葡萄醛酸代谢产物的量显著增加。Ko143对单葡萄糖醛酸代谢产物细胞内总量的影响显示其能够使细胞内单葡萄糖醛酸代谢产物的总量显著增加。而Ko143对单葡萄糖醛酸代谢产物细胞外和细胞内单葡萄糖醛酸代谢产物总量的影响则显示同一底物浓度时Ko143对单葡萄糖醛酸代谢产物细胞内外总量的影响很小。5μM的Ko143对三个浓度的木犀草素的Fmet没有产生影响,10μM的Ko143对Fmet产生的影响也很有限。当木犀草素底物浓度是10μM时,5和10μM的Ko143能够显著的降低代谢产物的清除率；当木犀草素底物浓度是40μM时,10μM Ko143能够显著降低代谢产物的清除率。结论1.我们首次在体外发现了木犀草素的三个双葡萄糖醛酸代谢产物,初步确定了其中一个双葡萄糖醛酸代谢产物的结合位点。深入的研究了三种化合物的UGT代谢机理,为提高其生物利用度及临床应用前研究提供基本的理论基础和示范性指导。2.UGT代谢和BCRP的外排的偶联作用是木犀草素生物利用度低的重要原因。当细胞内单葡萄糖醛酸代谢产物的量增加或是BCRP被抑制,木犀草素将会有一条新的处置途径即由单葡萄糖醛酸代谢产物代谢成为双葡萄糖醛酸代谢产物。