研究目的　　 热量限制(caloric restriction,CR)是指保证生物体不发生营养不良的情况下,降低热量摄取的营养供给标准。CR具有延缓衰老,降低氧化损伤,提高肌力,延缓或预防一些相关疾病等作用。其作用机制比较复杂,目前尚未有明确的结论。可能也与现今的有关理论大都是来自在体研究,而整体动物模型机制相对复杂、干扰因素多有关。有关CR体外模型的研究较少,而体外模型既可复制体内生物衰老等现象,还可排除体内一些因素的干扰。CR的体外模型可通过体外细胞培养方法来建立。故本研究通过改变培养基中葡萄糖的浓度,采用小鼠骨骼肌细胞(Mouse C3H musclemyoblas,C2C12)建立了热量限制的体外模型。通过该模型,观察了不同浓度的葡萄糖对骨骼肌细胞的代谢水平及氧化应激等的影响,并进一步探讨热量限制与延缓衰老、降低氧化损伤、延缓肌肉疲劳等方面的关系,为相关研究提供一定的方法和依据。　　 研究方法　　 本论文首先通过分别改变C2C12成肌细胞及肌管的培养基中葡萄糖的浓度来建立C2C12细胞不同时期的热量限制体外模型:　　 通过观察不同浓度的葡萄糖对细胞增殖、蛋白合成、ATP合成、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase,SOD)活性的影响,为建立CR的C2C12成肌细胞模型提供依据。在此模型的基础上,分别研究了含5 mM和25 mM葡萄糖的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium,DMEM)C2C12成肌细胞(C2C12myoblasts in DMEM at5 mM glucose,CB5:C2C12 myoblasts in DMEM at25 mMglucose,CS25)中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性、糖原水平和培养环境中大分子结构的变化情况,进而探讨了葡萄糖浓度对C2C12成肌细胞抗氧化损伤及细胞代谢水平的影响。　　 C2C12成肌细胞长满培养皿后开始分化,分化5天后,将成熟的肌管分别用糖浓度为5 mM和25 mM的分化DMEM培养基进行培养。先通过观察不同浓度的葡萄糖对肌管中蛋白的合成、ATP合成、SOD的情况,为建立CR的C2C12肌管模型提供依据。在此模型的基础上,分别观察了含5 mM和25 mM的分化DMEM培养基对C2C12肌管(C2C12 myotubes in differentiation medium at5 mM glucose,CT5:C2C12 myotubes in differentiation medium at25 mM glucose,CT25)qh ROS、CAT活性、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△ψ(z))、糖原水平和培养环境中大分子结构的变化的影响,进而研究了葡萄糖浓度对C2C12肌管的氧化应激及代谢水平的影响。　　 研究结果　　 1.葡萄糖浓度对C2C12成肌细胞的影响　　 (1)各浓度的细胞均出现了典型的生长曲线。以初始密度为2000/孔和3000/孔的细胞在培养2-3天后进入对数增殖期,而1000/孔组的细胞在移殖后4-5天才开始对数增长。不同糖浓度对细胞增殖的影响不明显。我们选取了2000/孔的种植密度,并选取35 mm皿的种植密度为3×104/皿。通过对糖处理浓度及处理时间的摸索,最终分别以葡萄糖浓度为5 mM和25 mM作为CB5组和CB25组,处理时间48 h来建立成肌细胞模型。　　 (2)CB5的细胞增殖水平显著低于CB25(P＜0.01)。　　 (3)CB5和CB25的蛋白合成均呈增长趋势,但CB5的增长趋势比CB25的低。　　 (4)CB5的SOD活性高于CB25,且处理48h时,CB5的SOD活性显著高于CB25(P＜0.01),且其提高的程度与葡萄糖处理的时间及浓度有关。　　 (5)与CB25相比,CB5的ATP水平显著提高(P＜0.01)。　　 (6)与CB25相比,CB5的CAT活性显著增强(P＜0.01)。　　 (7)通过DCFH-DA法和鲁米诺法观察均发现,培养48 h后,CB5的活性氧水平明显低于CB25(P＜0.01)。　　 (8)培养48h后,CB5的糖原水平显著低于CB25(P＜0.05)。　　 (9)培养48h后,CB5和CB25都可引起培养环境中大分子成分的变化:CB5和CB25与相应培养基对照相比均有极显著差异(P＜0.01)。CB5和CB25的细胞上清间的大分子成分有区别,但没有显著性差异(P＞0.05)。　　 2.葡萄糖浓度对C2C12肌管的影响　　 (1)在含不同浓度葡萄糖的分化培养基中,C2C12肌管总蛋白的含量随着培养的时间增加而增加,不同的糖浓度对肌管中总蛋白量的增加趋势有一定的影响。通过对糖浓度及处理时间的摸索,最终以5 mM和25 mM作为CT5组和CT25组的葡萄糖浓度,处理时间为48 h的条件建立了C2C12肌管模型。　　 (2)CT5比CT25的蛋白增加量较少,但没有显著性差异(P＞0.05)。　　 (3)培养48 h后,CT5中SOD的活性比CT25显著增强(P＜0.01),且SOD活性的增加与葡萄糖的处理时间及浓度有关。　　 (4)培养48 h后,CT5中ATP的活性比CT25显著增强(P＜0.001)。　　 (5)与CT25相比,CT5的CAT活性明显增强(P＜0.001)。　　 (6)通过DCFH法(P＜0.05)和鲁米诺法(P＜0.001)均观察发现,CT5的活性氧水平明显低于CT25。　　 (7)与CT25相比,CT5的线粒体膜电位水平显著提高(P＜0.001)。　　 (8)与CT25相比,CT5的糖原水平显著降低(P＜0.001)。　　 (9)C2C12肌管在生长过程中,CT5和CT25均可引起培养环境中大分子成分的变化:CT5和CT25和相应培养基对照相比均具极显著差异(P＜0.001)。C2C12肌管的CT5和CT25的细胞上清间的大分子成分的变化有极显著性差异(P＜0.001)。但含5 mM和25 mM的培养基对照组间的大分子结构成分具有一定的差异,但没有显著性差异(P＞0.05)。　　 研究结论　　 1.CR对C2C12成肌细胞的增殖和蛋白合成有一定的抑制作用。可见,热量限制应在一定的时期进行才更有利于大众健康。　　 2.CR能提高C2C12成肌细胞和肌管中相关抗氧化酶的活性和线粒体的功能。这对细胞氧化损伤的降低,延缓肌肉疲劳及提高大众健康水平等方面都具有积极的作用。　　 3.CR可影响C2C12成肌细胞及肌管的代谢水平,这为IBM及糖尿病致病机制的研究提供了新的方法和思路。