研究表明,植物在胁迫条件下经历的刺激记忆能够跨代遗传,当代受到的胁迫能够影响有性或无性后代对胁迫的反应。胁迫记忆现象在植物胁迫机制研究、抗逆新品种培育等方面具有重要意义。对于药用植物,胁迫记忆还能为次生代谢物质积累、药用植物高效栽培和中药道地性研究方面提供参考。本文中我们以白木香离体根为对象,创建出具有盐胁迫记忆效应的系列材料,搜索胁迫记忆相关的标志性化学物质和标志性基因,为白木香胁迫记忆现象的深入研究奠定基础。目的:建立白木香离体根的盐胁迫记忆体系,探究胁迫记忆体系中可溶性糖、抗氧化酶等变化规律,寻找胁迫记忆体系的标志性成分。并结合转录组技术,寻找相应标志性基因。方法:1.盐胁迫条件筛选以白木香离体不定根为实验材料,添加0、150、300、450 m mol/L的盐胁迫分别处理1、3、5 d,以生根率、侧根生长情况和脯氨酸含量变化为指标筛选盐胁迫条件,选取对再生指标变化不大且脯氨酸含量变化显著的盐胁迫条件用于后续实验。2.胁迫记忆体系的确立用筛选到的盐胁迫浓度处理连续三代白木香离体根,通过测定连续三代盐胁迫下侧根生长和脯氨酸含量来验证该系列材料是否具有“记忆效应”。随后测定胁迫记忆体系下抗氧化酶活性、可溶性糖含量和化学成分变化。3.胁迫记忆体系的转录组分析利用RNA-seq技术,提取总RNA并进行转录组测序,从转录组水平分析盐胁迫记忆体系的差异基因表达情况,同时筛选与脯氨酸和可溶性糖含量变化相关的基因、与植物次生代谢物质变化相关的基因,从中找出盐胁迫记忆的生物标志性基因。结果:1.盐胁迫条件筛选白木香离体根经0、150、300、450 m mol/L的盐处理后,次代根的生长随盐处理浓度的增加表现出生根率和侧根条数降低、侧根直径增加的趋势。其中低浓度下的生根率和侧根条数与对照组比较相差不大,且根长增加,提示低浓度(150 mmol/L)能够促进侧根的生长。盐处理后白木香离体根的脯氨酸含量显著升高。随着时间的增加,同一处理浓度下的脯氨酸含量呈先增后降的趋势,表现出对盐胁迫的适应过程。结果表明,150 mmol/L处理3 d的盐胁迫对白木香离体根的生长没有产生较大的抑制效应且使脯氨酸含量增高,因此将该浓度作为胁迫记忆实验浓度。2.胁迫记忆体系的确立用150 mmol/L处理3 d建立盐胁迫记忆体系,结果表明该体系下白木香离体根的生根率保持在100%水平,而三代根脯氨酸含量分别为95.37、218.91、1224.77μg/g,即随处理代数的增加上升显著,说明连续胁迫下产生了更快更强的响应,存在记忆效应。我们对胁迫记忆体系进行分析发现,可溶性糖的含量变化表现出记忆效应,即随盐胁迫处理代数的增加而增加。对比化学成分发现,胁迫后产生了8种新的化合物,其中N1、N2、N3分别新增7、6、5种化合物。而抗氧化酶含量则无显著变化规律。3.胁迫记忆体系的的转录组数据分析通过对得到的转录组数据进行处理,共获得48286条Unigene,GC百分含量为42.341%,通过与四大数据库进行比对,共注释到25575条unigene,注释率为52.966%。将Unigene与KEGG数据库进行比对,注释结果显示,共有5202条unigene注释到132条KEGG通路中。连续胁迫三代的白木香离体根中差异基因数量变化不大,上调的差异基因数量减少,下调差异基因数量增加。KEGG注释结果显示,显著变化的通路有42条,我们重点关注与脯氨酸合成、可溶性糖合成与降解、次生代谢等相关的变化通路,最终筛选到了与脯氨酸合成相关的P5CSB、TPRP-F1、SPE2、PIP、ASP1等,与糖类合成和降解相关的PFK3、At3g03250、SDH等,次生代谢过程中与黄酮类合成相关的C12RT1、FLS、CYP98A2、CYP73A11、CHS等,以及与盐胁迫相关的PMA4、AVP1等关键基因。我们对其中部分表达量高的基因进行荧光定量PCR验证,其变化趋势与转录组结果一致,说明转录组数据可信。同时分析发现,SPE2、P5CSB基因在胁迫记忆体系中连续三代的表达量持续增加,且与脯氨酸含量表现出显著正相关,TPRP-F1在连续三代盐胁迫中的表达量与脯氨酸含量呈显著负相关,推测此3种基因可以作为胁迫记忆体系中与脯氨酸含量相关的分子标志基因。结论:本实验建立了白木香离体根的盐胁迫记忆体系,随后对胁迫记忆体系中的物质变化和转录组进行分析,最终筛选到与脯氨酸合成显著相关的3种基因作为其分子水平的标志基因。