随着不孕症发病率逐年升高,体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）技术成为治疗不孕症的重要手段。控制性卵巢刺激（control ovarian stimulation,COS）是通过注射外源性促性腺激素调控卵巢内多个卵泡同时发育的干预过程,是IVF过程中关键步骤。单次移植的成功率很低,6个IVF-ET的累计活产率仅约65.3%,临床上重复COS十分常见。受精卵由精卵结合而成,卵母细胞作为来源于母亲的生殖细胞,具有传递遗传物质,储备营养能量的重要作用。重复COS后颗粒细胞线粒体功能下降已被证实,影响线粒体功能的重要因素即氧化应激状态的存在。卵母细胞与颗粒细胞同处于卵泡中,线粒体作为卵母细胞胞质中含量最为丰富的细胞器,为卵母细胞发育及早期胚胎发育提供能量,是评价卵母细胞胞质成熟的重要指标。卵母细胞线粒体是否受到影响值得研究。课题组前期研究发现,补肾法能够调节卵母细胞分泌因子表达,提高卵母细胞质量,并具有提高排卵障碍模型大鼠卵巢的抗氧化能力,降低氧化产物水平,改善卵巢功能的作用。本论文拟研究重复COS是否会造成卵巢氧化应激状态,观察补肾法对重复COS后卵母细胞的影响及其作用机制,以期揭示补肾法通过改善氧化应激状态,提高卵母细胞质量,发挥调经种子作用的可能机制,丰富“肾主生殖”的科学内涵。第一部分补肾法对重复COS小鼠卵巢抗氧化应激能力的影响目的:研究重复COS对小鼠抗氧化酶活性、抗氧化能力的影响及是否对卵巢组织蛋白、脂质及核酸成分造成氧化损伤,并观察补肾调经方对重复COS后小鼠卵巢组织氧化损伤作用。方法:将40只8-10周龄雌性昆明小鼠适应性喂养一周,每天早9:00阴道涂片观察动情周期,随机分为4组,补肾高剂量组、补肾低剂量组、模型组及空白组,每组各10只。模型组及补肾高、低剂量组每日上午9:00分别灌胃蒸馏水及补肾调经方,1m L/100g体重,连续10天。模型组及补肾各组于第11日同时腹腔注射PMSG 10IU/只,48小时后腹腔注射HCG10IU/只。空白组每日阴道涂片观察动情周期。重复以上过程3周期,每周期间隔4天。模型组及补肾高、低剂量组小鼠在COS第3周期注射PMSG后46h,拟注射HCG前脱颈椎处死,将两侧卵巢摘除,迅速冻于液氮中保存。空白组在观察到发情期后10h脱颈椎处死,摘取卵巢,液氮冻存。使用时将卵巢由液氮中取出,置于冰上,加PBS匀浆,离心后取上清进行检测。采用ELISA试剂盒检测8-OHd G、AOPP、MDA、SOD、GSH-Px及T-AOC的水平。结果:1各组卵巢组织8-OH-d G含量的比较与正常组比较,补肾高剂量组卵巢组织8-OHd G含量无统计学差异（P>0.05）,补肾低剂量组8-OHd G含量升高（P<0.05）,模型组8-OHd G含量显著升高（P<0.01）;与模型组比较,补肾高剂量组、正常组8-OHd G含量显著降低（P<0.01）,补肾低剂量组8-OHd G含量无统计学差异（P>0.05）;补肾高、低剂量组之间比较,补肾高剂量组8-OHd G更低,差异具有统计学意义（P<0.05）。2各组卵巢组织AOPP含量的比较与正常组比较,补肾高、低剂量组卵巢组织AOPP含量升高（P<0.05）,模型组AOPP含量显著升高（P<0.01）;与模型组比较,补肾高、低剂量组AOPP含量显著降低（P<0.01）,正常组AOPP含量显著降低（P<0.01）。补肾高低剂量组之间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3各组卵巢组织MDA含量的比较补肾高、低剂量组与正常组卵巢组织MDA含量比较,差异无统计学意义（P>0.05）,模型组MDA含量明显高于正常组（P<0.01）;与模型组比较,补肾高、低剂量组及正常组MDA含量明显降低（P<0.01）;补肾高、低剂量组之间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。4各组卵巢组织SOD活力的比较补肾高、低剂量组卵巢组织SOD活力与正常组比较,差异无统计学意义（P>0.05）,模型组SOD活力较正常组明显降低（P<0.01）;与模型组比较,补肾高、低剂量组及正常组SOD活力明显升高（P<0.01）;且补肾高、低剂量组SOD活力差异具有统计学意义（P<0.05）,补肾高剂量组SOD活力更高。5各组卵巢组织GSH-Px活力的比较补肾高、低剂量组卵巢组织GSH-Px活力与正常组比较,差异无统计学意义（P<0.05）,模型组GSH-Px活力较正常组显著降低（P<0.01）;与模型组比较,补肾高、低剂量组及正常组GSH-Px活力显著增高（P<0.01）;补肾高、低剂量组之间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。6各组卵巢组织T-AOC比较补肾高低剂量组卵巢组织T-AOC水平与正常组比较,差异无统计学意义（P>0.05）,模型组T-AOC较正常组显著降低（P<0.01）;与模型组比较,补肾高、低剂量组及正常组T-AOC增高（P<0.05）。补肾高低剂量组之间差异不具有统计学意义（P>0.05）。小结:1重复COS会提高小鼠卵巢组织核酸、蛋白质及脂质的氧化损伤水平,影响小鼠卵巢中抗氧化酶的活性,造成小鼠卵巢组织的氧化应激状态。2补肾调经方能够降低重复COS小鼠卵巢组织的核酸、蛋白质及脂质的氧化损伤标志物水平,提高小鼠卵巢组织抗氧化酶的活性,有助于消除重复COS对小鼠卵巢组织造成的氧化应激状态,纠正卵巢氧化/抗氧化失衡,调节机体至“阴平阳秘”状态。3重复COS可能通过影响卵巢组织氧化应激状态进而影响卵母细胞发育,降低卵母细胞质量。补肾调经方可通过纠正卵巢氧化应激状态,以改善卵母细胞质量。其机制有待进一步研究。第二部分补肾法对重复COS小鼠卵母细胞线粒体功能的影响目的:研究重复COS对小鼠卵母细胞ROS量及线粒体功能的影响,并观察补肾调经方对重复COS小鼠卵母细胞线粒体功能的作用。方法:将48只8-10周龄健康清洁级雌性昆明小鼠适应性喂养后,每天早9:00阴道涂片观察动情周期,随机分为4组,补肾高剂量组、补肾低剂量组、模型组及空白组,每组各12只。模型组及补肾高、低剂量组每日上午9:00分别灌胃蒸馏水及补肾调经方,1m L/100g体重,连续10天。模型组及补肾各组于第11日同时腹腔注射PMSG 10IU/只,48小时后腹腔注射h CG 10IU/只。空白组每日阴道图片观察动情周期。重复以上过程3周期,每周期间隔4天。模型组及补肾高、低剂量组小鼠在超促排卵第3周期注射HCG后14-16h,空白组于观察到动情期后12h,脱颈椎处死小鼠,剪开腹壁,充分暴露后取出输卵管,在PBS中清洗去血液,将输卵管置于M16培养液中,用1m L注射器针头划破输卵管膨大处,卵丘卵母细胞复合物（COCs）溢出,透明质酸酶消化,去除颗粒细胞后收集于无菌Ep管中,一部分液氮冻存检测ROS水平;一部分立即送染色,激光共聚焦显微镜检测线粒体功能。采用DCFH-DA染色,共聚焦显微镜观察ROS水平;采用Mito Tracker Red染色,共聚焦显微镜观察卵母细胞线粒体分布;采用荧光素酶法检测卵母细胞ATP量;采用JC-1染色,共聚焦显微镜观察卵母细胞膜电位（MMP）;实时荧光定量PCR检测卵母细胞mt DNA拷贝数。结果:1各组卵母细胞ROS水平的比较与正常组卵母细胞ROS水平比较,补肾高、低剂量组差异无统计学意义（P>0.05）,模型组卵母细胞ROS水平较正常组显著升高（P<0.01）;与模型组卵母细胞ROS水平比较,补肾高、低剂量组均降低,其中补肾高剂量组降低显著（P<0.01）;补肾高、低剂量组间比较,高剂量组ROS水平较低,差异具有统计学意义（P<0.05）。2各组卵母细胞mt DNA拷贝数比较与正常组比较,补肾高、低剂量组卵母细胞mt DNA拷贝数差异无统计学意义（P>0.05）,模型组mt DNA拷贝数较正常组显著降低（P<0.01）;与模型组比较,补肾高剂量组mt DNA明显升高（P<0.01）,补肾低剂量组及正常组mt DNA升高（P<0.05）;补肾高低剂量组之间比较,卵母细胞mt DNA拷贝数差异无统计学意义（P>0.05）。3各组卵母细胞ATP含量比较与正常组比较,补肾高、低剂量组卵母细胞ATP含量差异无统计学意义（P>0.05）,模型组ATP含量较正常组下降（P<0.05）;与模型组比较,补肾高剂量组ATP含量升高明显（P<0.01）,补肾低剂量组及正常组ATP含量升高（P<0.05）;补肾高、低剂量组之间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。4各组卵母细胞MMP强度的比较与正常组比较,补肾高、低剂量组卵母细胞MMP平均强度差异无统计学意义（P>0.05）,模型组MMP平均强度较正常组明显降低,（P<0.01）;与模型组比较,补肾低剂量组MMP强度升高（P<0.05）,补肾高剂量组及正常组MMP平均强度明显增高,差异具有显著性（P<0.01）;补肾高剂量组MMP平均强度高于低剂量组（P<0.05）。5各组卵母细胞线粒体分布补肾高/低剂量组、模型组及正常组卵母细胞线粒体均匀分布的比率分别为79.2%,73.9%,69%及80.9%。卡方检验结果显示,补肾高/低剂量组及正常组线粒体均匀分布比率均高于模型组,但四组之间差异不具有统计学意义（P>0.05）。小结:1重复COS会影响卵母细胞ROS水平、线粒体mt DNA拷贝数及MMP强度,影响卵母细胞ATP的水平,降低卵母细胞质量。2补肾调经方能够降低重复COS后卵母细胞ROS水平,提高重复COS后卵母细胞线粒体mt DNA拷贝数、MMP强度及其ATP水平,改善重复COS后卵母细胞质量,且高剂量补肾调经方改善线粒体MMP强度的效果更优。3补肾调经方能够提高重复COS后卵母细胞质量与其改善卵母细胞线粒体功能有关,可作为治疗临床重复COS后卵母细胞质量下降的辅助用药。第三部分体外培养小鼠卵母细胞形态学变化及补肾法对体外培养氧化应激状态卵母细胞ROS水平及PB1排出率的影响目的:研究体外培养卵母细胞发育过程中卵母细胞形态学变化,添加氧化剂H₂O₂对卵母细胞ROS水平及PB1排出率的影响,并观察补肾调经方对上述指标的影响。方法:选用8只6-7周龄健康雌性SD大鼠,适应性饲养后每日灌胃补肾调经方2次,1m L/200g体重（相当于临床等效剂量）,连续3天。于第4日禁食12h后,一次性灌服全天剂量。给药1h后水合氯醛腹腔注射麻醉,股动脉取血。室温静置2h后离心,留取血清,56℃水浴30min灭活补体,0.22μm无菌滤器过滤除菌,得到补肾调经方含药血清,-80℃保存备用。选用15只24-26日龄小鼠每只注射PMSG 5IU促排卵,44h后脱颈椎法处死小鼠。消毒后分离完整卵巢,清洗去除血液及多余组织,置于预热的M2培养液中,体视显微镜下使用注射器针轻柔撕裂卵巢组织,挑破较大有腔卵泡,选择大小均一、包裹3-5层卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合物（COCs）,清洗后移入35mm培养皿中,添加2m L IVM培养液（α-MEM基础培养基+10%FBS+100m IU/m L r FSH+1.5 U/m Lh CG+3ng/m L EGF+100IU/rn L青霉素+100μg/m L链霉素）。培养皿置于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中培养。将收集的卵母细胞随机分为3组分别培养。（1）正常组:IVM培养液培养至14-16h;（2）补肾组:IVM培养液添加10%补肾调经方含药血清培养2h,再给予H₂O₂,继续培养至14-16h;（3）H₂O₂组:IVM培养液培养2h,添加100μM浓度H₂O₂,培养至14-16h。倒置显微镜观察COCs发育过程中形态学变化。将COCs置于吹打消化,脱去颗粒细胞后倒置显微镜下统计PB1排出率。DCFH-DA染料染色,共聚焦显微镜观察ROS水平。结果:1卵丘-卵母细胞复合物在IVM培养过程中形态学变化GV期COCs中,卵母细胞可见透明带,卵母细胞周围可见多层、致密卵丘细胞包裹。IVM 16-18h后,COCs体积增大,卵丘扩张生长并且结构松散,中间可见卵母细胞轮廓。100U/m L透明质酸酶消化培养后的COCs,移液器吹打消化,MⅠ期卵母细胞无第一极体排出,MⅡ期卵母细胞可见明显卵周间隙,卵周间隙可见第一极体。2各组间卵母细胞ROS水平比较与正常组比较,补肾调经方组ROS水平的差异无统计学意义（P>0.05）,H₂O₂组较正常组ROS水平显著升高（P<0.01）;补肾调经方与H₂O₂组比较,卵母细胞ROS水平显著降低（P<0.01）。3各组间卵母细胞PB1排出率的比较统计结果显示,与正常组比较,卵母细胞PB1排出率补肾调经方组差异无统计学意义（P>0.05）,H₂O₂组卵母细胞PB1排出率较正常组显著降低（P<0.01）;补肾调经方组与H₂O₂组比较,卵母细胞PB1排出率显著增高（P<0.01）。小结:1在体外培养卵母细胞培养液中添加H₂O₂可引起卵母细胞中ROS增加,PB1排出率降低,造成卵母细胞氧化应激模型。2体外培养卵母细胞培养液中添加补肾调经方含药血清可降低H₂O₂引起的卵母细胞内ROS的堆积,提高卵母细胞PB1排出率,提示补肾调经方具有改善卵母细胞氧化应激状态,提高卵母细胞成熟率的作用。第四部分补肾调经方对体外培养小鼠卵母细胞氧化应激初期Nrf2抗氧化应激通路的影响目的:研究体外培养小鼠卵母细胞氧化应激初期对Nrf2信号通路及下游抗氧化酶的影响,及添加补肾调经方含药血清培养对氧化应激初期卵母细胞Nrf2信号通路及下游抗氧化酶的影响。方法:选用24只6-7周龄健康雌性SD大鼠,制备补肾调经方含药血清,方法同第三部分。选用60只24-26日龄昆明小鼠,机械法分离GV期卵丘-卵母细胞复合物,方法同第三部分。将收集的卵母细胞随机分为3组分别培养。（1）正常组:IVM培养液培养6小时;（2）补肾组:IVM培养液添加10%补肾调经方含药血清培养4h,再给予H₂O₂,继续培养至6h;（3）H₂O₂组:IVM培养液培养4h,添加100μM浓度H₂O₂,培养至6h。收集COCs,100U/m L透明质酸酶中,吹打消化,脱去颗粒细胞,收集后一部分立即行免疫荧光检测;一部分-80℃冻存用于RT-PCR检测。结果:1各组体外培养小鼠卵母细胞中PKC、Keap1、Nrf2、SOD、GSH-PxmRNA的比较1.1各组卵母细胞中PKC、Keap1、Nrf2 mRNA含量的比较PKC mRNA表达:与正常组比较,H₂O₂组及补肾组PKC mRNA表达均显著升高（P<0.01）;与H₂O₂组比较,补肾组PKC mRNA表达显著升高（P<0.01）。Keap1 mRNA表达:正常组、H₂O₂组及补肾组之间Keap1 mRNA表达比较,差异均不具有统计学意义（P>0.05）。Nrf2 mRNA表达:与正常组比较,H₂O₂组及补肾组Nrf2 mRNA表达显著升高（P<0.01）;与H₂O₂组比较,补肾组Nrf2 mRNA表达升高（P<0.05）。1.2各组卵母细胞中Mn SOD及GSH-Px mRNA含量的比较Mn SOD mRNA表达:与正常组比较,H₂O₂组Mn SOD mRNA表达升高（P<0.05）,补肾组表达显著升高（P<0.01）;与H₂O₂组比较,补肾组Mn SOD mRNA表达显著升高（P<0.01）。GSH-Px mRNA表达:与正常组比较,H₂O₂组及补肾组GSH-Px mRNA表达均显著升高（P<0.01）;与H₂O₂组比较,补肾组GSH-Px mRNA表达显著升高（P<0.01）。2各组体外培养小鼠卵母细胞中PKC、p-PKC、Keap1、Nrf2、p-Nrf2蛋白表达的比较PKC蛋白表达:各组之间卵母细胞中PKC蛋白表达差异不具有统计学意义（P>0.05）;p-PKC蛋白表达:与正常组比较,H₂O₂组p-PKC蛋白表达升高（P<0.05）,补肾组表达显著升高（P<0.01）;与H₂O₂组比较,补肾组p-PKC蛋白表达显著升高（P<0.01）。p-PKC/PKC表达:与正常组比较,H₂O₂组升高（P<0.05）,补肾组显著升高（P<0.01）;与H₂O₂组比较,补肾组显著升高（P<0.01）。Keap1蛋白表达:各组之间卵母细胞中Keap1蛋白表达差异均不具有统计学意义（P>0.05）。Nrf2蛋白表达:与正常组比较,H₂O₂组及补肾组Nrf2蛋白表达均升高（P<0.05）;H₂O₂组与补肾组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。p-Nrf2蛋白表达:与正常组比较,H₂O₂组及补肾组p-Nrf2蛋白表达显著升高（P<0.01）;与H₂O₂组比较,补肾组p-Nrf2蛋白表达显著升高（P<0.01）。p-Nrf2/Nrf2比值:与正常组比较,H₂O₂组及补肾组p-Nrf2/Nrf2比值显著升高（P<0.01）;与H₂O₂组比较,补肾组p-Nrf2/Nrf2显著升高（P<0.01）。小结:1氧化应激可激活Nrf2信号通路,引起Nrf2 mRNA表达增加,及其下游抗氧化酶Mn SOD、GSH-Px的基因转录。2氧化应激初期Nrf2蛋白活性升高与Keap1表达水平无明显关系,可能与PKC提高Nrf2磷酸化水平,使其自Keap1解离有关。3补肾调经方能够减少氧化应激后卵母细胞ROS水平,其机制可能与其调控氧化应激初期PKC-Nrf2信号通路转导,提高下游抗氧化酶基因转录有关。结论:重复控制性卵巢刺激会引起卵巢抗氧化能力下降,抗氧化酶活性降低,氧化损伤产物增多,并影响卵母细胞线粒体功能,降低卵母细胞质量。补肾法能够改善重复COS后卵巢抗氧化能力,提高抗氧化酶活性,减少卵巢氧化损伤,并能够改善卵母细胞线粒体功能,其机制可能是通过使卵母细胞内PKC表达升高,激活Nrf2基因转录,提高Nrf2蛋白活性,诱导Nrf2信号通路下游抗氧化酶基因表达,提高卵母细胞抗氧化能力,发挥其改善卵母细胞质量的作用。