聚合酶链反应(PCR)技术已成功应用于食品中动物源性成分的鉴别检测,但是较高的仪器和技术要求限制了其在现场及资源有限的基层实验室中的应用。环介导等温扩增法(LAMP)具有与PCR类似的检测灵敏度和特异性,但是无需热循环设备并且耐受食品样品抑制剂,更适用于食品中动物源性成分的现场快速检测。为充分发挥LAMP技术在食品检测领域的优势,本研究以乳及乳制品中牛羊源性成分作为检测对象,从简化模板预处理和建立闭管目视检测方法两方面,研究建立适用于现场的快速检测方法,具体研究内容和结果如下:(1)羊乳中牛乳成分的直接实时LAMP检测。根据线粒体保守序列选取牛、羊特异性引物,建立了无需核酸提取的直接实时LAMP技术,用于羊乳中掺入牛乳成分的检测。结果表明,所建立的LAMP方法特异性好,对牛、羊的检测灵敏度可达0.07pg/μL和0.7pg/μL,在掺假样品中直接实时LAMP技术可检测到掺入1%的牛乳成分。通过对10种市售羊乳制品检测显示,直接实时LAMP方法与经DNA提取的实时LAMP方法检测结果一致。所建立方法避免了繁杂费时的核酸提取过程,仅对样品简单处理即可直接进行LAMP扩增反应,简化了样品前处理过程,适用于羊乳制品中牛乳成分的现场快速检测。(2)羊乳中牛乳成分的双重LAMP检测。为了提高检测效率,节省时间、试剂和样本,进一步研究建立了基于LAMP扩增产物熔解温度(Tm)差异的双重LAMP检测方法。通过引物设计优化,牛引物扩增产物的Tm值在80℃,羊扩增产物的Tm值在83℃,利用Tm值的差异实现了两种不同动物源性成分的有效区分。该方法特异性好,不需要针对牛、羊源性成分单独进行检测,当体系中存在其中一种或两种都存在时都可将其快速检出,且对其他物种没有交叉反应及假阳性现象的发生,可通过熔解峰的高度值实现对掺假比例的相对定量,成功应用于市售羊乳及其制品的检测。(3)羊乳中牛乳成分的可视化LAMP检测。LAMP技术能够通过荧光目视比色快速鉴别扩增产物,但常用的有机荧光染料稳定性差、斯托克斯(stoke’s)位移小等导致荧光颜色区分不够明显。基于此,本研究采用核酸分子“光开光”钌(Ⅱ)配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为荧光染料,建立了一种简便、快速、直观地检测羊乳制品中掺入牛乳成分的可视化LAMP方法。结果显示,将染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+在LAMP扩增反应完成后加入,即可通过蓝光投射仪观察判断有无扩增反应发生,当有目标DNA存在时发射出强烈的红色荧光,与激发的蓝光对比明显,目视比色更容易区分。该方法具有良好的特异性和灵敏性,在混合样品中可检测羊乳中掺假0.1%牛乳。(4)羊乳中牛乳成分的闭管可视化LAMP检测。由于LAMP反应的高灵敏度,反应后开盖加入[Ru(bpy)2(dppz)]2+染料容易导致气溶胶污染。为了避免污染和高浓度染料直接加入对LAMP扩增反应的抑制作用,进一步设计优化了简单的管内分隔装置。LAMP扩增试剂与检测染料都在反应前加入但相互之间并不接触,待扩增反应完成后再将两者混合产生荧光信号,既实现了高灵敏荧光检测同时也避免了由于开盖引起的气溶胶污染问题。通过对扩增检测条件的优化可在40min内特异性的检测出羊乳中掺假0.1%的牛乳。该方法具有快速、直观、低成本、污染风险小等优点,可以为羊奶真实性现场快速检测提供技术支持。