猪呼吸道冠状病毒(Porcine Respiratory Coronavirus,PRCV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)同属冠状病毒，PRCV是TGEV的缺失变异株，两者同源性高达98％。PRCV为猪呼吸道综合征(PRDC)的主要病原体之一，主要引起猪的严重呼吸道症状，使得猪的生产性能下降而引起重大的经济损失。TGEV主要引起1周龄以内仔猪发生呕吐，严重急性腹泻和脱水为特征的胃肠炎，死亡率极高，同样给养猪业造成巨大的经济损失。PRCV S<,1>基因位于PRCV N端816bp，与TGEV高度同源，而且基因高度保守，能诱导产生中和抗体和提供免疫保护的结构蛋白。本实验的研究目的是构建PRCV S<,1>基因的重组腺病毒表达载体，为PRCD和TGE基因工程活载体疫苗的研究奠定基础。 本实验以PRCV AR310毒株为研究对象，初步了解PRCV在三种不同细胞中的生长繁殖情况，并参考GenBbank中已发表的基因序列，设计和合成一对引物，通过RT-PCR扩增出PRCV AR310株的S<,1>基因，克隆到pMD18-T Simple Vector中并测序。序列测定结果运用DNAStar软件进行了分析，结果表明与PRCV DQ811787核苷酸同源性为100％，与M94096、M94097的同源性分别为95.2％和95.0％；氨基酸推测分析表明，试验测序的PRCV S<,1>基因氨基酸序列与Genebank中DQ811787同源性为100％，与M94096、M94097的同源性分别为95.2％和95.6％。氨基酸高度保守。 实验采用新型的腺病毒表达系统，通过Cre-loxP介导的位点特异性重组方法，将中间载体pDNR-1r-S<,1>两个lox元件之间的目的基因序列转移到表达载体上，获得表达载体pint．AV1．SpaT-S<,1>；pint．AV<,1>．SpaT-S<,1>经PMLI、PacI酶切线性化后，与经ClaI酶切的pInt．B．B质粒(含腺病毒骨架基因)线性化产物一起，在脂质体介导下转染293细胞，转染后第7天，293细胞开始出现CPE,提取细胞裂解液中DNA，经PCR检测和序列测定结果表明，PRCV S<,1>已经正确插入到重组腺病毒的基因组中。Western-blotting和间接免疫荧光实验，证明PRCV S<,1>基因在293细胞中成功获得了表达。第二代重组腺病毒滴度TCID<,50>达7×10<7>：PFU/mL。