【摘 要】
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酿酒酵母是微生物工业生产中重要的一类安全微生物,常被用作化合物合成的细胞工厂。酿酒酵母在长期演变过程中形成了Crabtree效应,乙醇是酿酒酵母Crabtree效应的重要产物。在Crabtree阳性酿酒酵母中生产乙醇外的其他目标产物时,碳源大量流向乙醇,造成目标产物转化率低下。为了提高酿酒酵母中目标产物的转化率,减少代谢流的损耗,敲除了丙酮酸脱羧酶基因,消除了酿酒酵母体内乙醇的生成。但是这一类丙酮
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酿酒酵母是微生物工业生产中重要的一类安全微生物,常被用作化合物合成的细胞工厂。酿酒酵母在长期演变过程中形成了Crabtree效应,乙醇是酿酒酵母Crabtree效应的重要产物。在Crabtree阳性酿酒酵母中生产乙醇外的其他目标产物时,碳源大量流向乙醇,造成目标产物转化率低下。为了提高酿酒酵母中目标产物的转化率,减少代谢流的损耗,敲除了丙酮酸脱羧酶基因,消除了酿酒酵母体内乙醇的生成。但是这一类丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株在以葡萄糖为碳源的培养基中无法生长,所以引入新的乙酰辅酶A合成途径结合实验室适应性进化以及反向代谢工程,获得了以葡萄糖为碳源的Crabtree阴性酿酒酵母菌株,其最大比生长速率达到0.218 h-1,该菌株没有副产物乙醇生成,具有高转化率合成目的产物的潜力。以Crabtree阴性酿酒酵母菌株为出发菌株,通过合成生物学的方法构建生产不同目标产物的菌株,验证Crabtree阴性酿酒酵母菌株代谢的优势。丙酮酸、丙二酰辅酶A以及甲羟戊酸是三个关键代谢节点,这三种化合物是很多重要工业化合物的关键前体,酿酒酵母中通过这三个节点可以合成萜类、脂肪酸等在工业、生物燃料等多方面有着重要用途的化合物。过表达内源基因,提高丙酮酸衍生物2,3-丁二醇的产量;引入外源途径酶改造甲羟戊酸途径,获得萜类化合物番茄红素合成菌株;引入外源基因,增强丙二酰辅酶A下游关键酶表达,获得3-羟基丙酸合成菌株;优化脂肪酸合成途径,加强前体物供应,提高了脂肪酸的合成。与野生型菌株相比,发现Crabtree阴性酿酒酵母菌株中代谢流在合成上述产物时优势明显。Crabtree阴性酿酒酵母中2,3-丁二醇、番茄红素、3-羟基丙酸、脂肪酸的单位OD产量分别是野生型的6.6、3.5、1.2和2.3倍。其中,Crabtree阴性酿酒酵母里2,3-丁二醇、番茄红素、3-羟基丙酸和脂肪酸的转化率相较于野生型分别提高了4.3、1.8、0.2、1.5倍。尽管Crabtree阴性酿酒酵母生长速率较野生型菌株慢,但其更高产量和转化率的优势证明该平台菌株有着作为工业菌株生产各类化合物的潜力。
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