论文部分内容阅读
衰老是阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）发病的最关键的危险因素,衰老与阿尔兹海默病以记忆衰退为临床特征,共同的神经病理学表现包括Aβ淀粉样斑块沉积,但是目前我们并不了解衰老是如何促进神经退行性疾病发生的。基因表达的表观遗传调控在学习和记忆中发挥重要作用,DNA甲基化作为表观遗传调控的重要组成部分,会影响海马突触可塑性和长期记忆形成。DNA甲基化主要由DNMT1、DNMT3A、DNMT3B这三种甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）介导,DNMTs是老年期的记忆维持所必需的。研究发现老年人大脑会发生DNA甲基化失调,这与记忆衰退有关甚至会导致记忆损害,提示异常DNA甲基化是衰老相关的认知功能障碍的驱动因素。我们前期研究显示成年小鼠Dnmt1,Dnmt3a双敲除会导致ST6Gal2在海马的表达显著上调,同时小鼠出现海马依赖性位置识别记忆障碍。ST6Gal2属于唾液酸转移酶家族,唾液酸转移酶将唾液酸与细胞膜糖蛋白或糖脂末端结合,即唾液酸化过程。唾液酸化具有调节免疫系统、调节突触可塑性等多种生物学功能。ST6Gal家族包括ST6Gal1和ST6Gal2,ST6Gal2在人体组织中的表达模式特异性方面不同于ST6Gal1,ST6Gal1在人体组织中普遍表达,而ST6Gal2主要在胚胎组织以及中枢神经系统有明显表达,尤其是在海马和前额叶皮层中表达丰富。ST6Gal1可增加淀粉样前体蛋白唾液酸化并促进Aβ的聚集,但目前关于ST6Gal2对脑功能尤其是认知功能的影响鲜有报道。本课题的研究目的是探讨Dnmt1和Dnmt3a共敲除对衰老小鼠学习记忆的影响,以及ST6Gal2在衰老相关记忆障碍中的调控作用并探讨可能的机制。我们以Cre依赖的小鼠CA1区兴奋性αCa MKII-Cre+神经元中Dnmt1和Dnmt3a条件性敲除（Conditional-knockout,CKO）小鼠即αCa MKII-Cre;Dnmt1,3a2flox/2flox小鼠为研究对象,通过定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR）技术对衰老小鼠（大于18个月龄）与年轻小鼠（6月龄）海马CA1区St6gal2的表达进行定量分析和比较,利用高架十字迷宫、旷场实验测定小鼠自发活动及焦虑状态,利用新位置识别实验和Morris水迷宫行为学范式测试小鼠的学习记忆。另一方面,我们结合脑区立体定位和AAV病毒注射的方法在C57BL/6J小鼠背侧海马d CA1区过表达St6gal2,考察其对学习记忆的影响是否与条件性Dnmt1和Dnmt3a双敲除小鼠结果相一致。最后,我们向衰老αCa MKII-Cre;Dnmt3a,12flox/2flox小鼠海马d CA1脑区注射St6gal2干扰病毒以对抗St6gal2的高表达,观察小鼠的识别记忆障碍能否得到改善,利用酶联免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法测定海马区Aβ1-40、Aβ1-42和IL-6的含量,利用荧光免疫组化观察小鼠海马Aβ斑块聚集情况。我们的研究发现:1.与同龄对照Dnmt1,3a2flox/2flox小鼠相比,衰老及年轻αCa MKII-Cre;Dnmt1,3a2flox/2flox双敲除小鼠海马区St6gal2 m RNA表达均上调,且在衰老鼠中上调更为显著;2.与同龄对照Dnmt1,3a2flox/2flox小鼠相比,衰老αCa MKII-Cre;Dnmt1,3a2flox/2flox小鼠出现更加明显的海马依赖性记忆障碍;3.病毒介导海马d CA1区St6gal2高表达导致衰老C57BL/6J小鼠出现海马依赖的记忆障碍;St6gal2高表达不影响小鼠的自发活动及焦虑状态;4.与同龄对照Dnmt1,3a2flox/2flox小鼠相比,衰老αCa MKII-Cre;Dnmt1,3a2flox/2flox小鼠海马区可溶性Aβ1-40、Aβ1-42和IL-6含量增加,且出现Aβ异常聚集;5.海马d CA1区注射St6gal2小干扰RNA减少衰老αCa MKII-Cre;Dnmt1,3a2flox/2flox小鼠海马区Aβ异常聚集,同时改善小鼠海马依赖的记忆障碍;综上所述,我们的研究表明海马ST6GAl2对记忆有重要的调节作用,ST6Gal2表达的异常升高促进衰老向神经退行性变的转化并导致记忆障碍。具体来说,我们认为衰老加剧了Dnmt1和Dnmt3a缺失造成的St6gal2 DNA低甲基化修饰,从而导致ST6Gal2的转录和表达异常增加。ST6Gal2参与老年Aβ斑块沉积的病理过程,促进衰老向神经退行性变转化,最终导致老年小鼠出现类似AD的记忆障碍。ST6Gal2的表达上调促进衰老过程中神经退行性变的发生。因此,动态监测脑内ST6Gal2水平的变化可能有助于AD神经退行性变发生的早期筛查和诊断。