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银杏叶为银杏的干燥叶,其提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)及制剂广泛应用于临床,具有改善微循环、扩张心脑血管、抗氧化、清除和抑制氧自由基、抗菌消炎、抗病毒等药理作用。随着药理作用机制的深入研究和药物提取工艺标准化的提出,银杏叶的药用价值在农药、兽药和医药等多方面得已体现,在口腔医学领域中也得到越来越广泛的应用,但其对牙周病的治疗机理尚不明确。人牙周膜细胞(Periodental ligament cells, PDLCs)作为牙周组织中的主要功能细胞,具有多向分化潜能,在牙周组织再生修复中发挥重要作用。目的：通过观察GBE对体外培养人PDLCs增殖及其细胞周期的影响以及脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)介导下GBE对人PDLCs分泌细胞因子的影响。从细胞水平证实GBE对人PDLCs的保护作用,并初步探讨GBE在牙周病治疗中的作用机理,为GBE在牙周病治疗方面的应用提供实验与理论基础。方法：本研究分三个部分实验一改良组织块培养法体外培养人牙周膜细胞及其生物学特性观察。采用改良组织块培养法,体外培养PDLCs。常规苏木精-伊红(Haematoxylin-eosine stain, HE)染色进行形态学观察,采用免疫组织化学鉴定法鉴定细胞来源。实验二银杏叶提取物对人牙周膜细胞增殖及细胞周期的影响。1.噻唑蓝(methyl thiazolil tetracolium, MTT)比色法测定GBE对人PDLCs增殖的影响。取4-7代人PDLCs,用0.25%胰蛋白酶消化后调整细胞浓度为1×104/ml,接种于96孔细胞培养板,培养24h待细胞贴壁后,按实验分组分别加入含10%胎牛血清(Fetal boving serum, FBS)及不同浓度GBE的DMEM培养液(Dulbecco minimal essential medium,DMEM)(含GBE浓度分别为1、0.1、0.01、0.001mg/ml),对照组为只含10%FBS的DMEM,每组4复孔。分别培养12、24、48、72h后进行MTT检测。2.流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)测定GBE对人PDLCs细胞周期的影响,按实验分组分别加入含10%FBS及不同浓度的GBE的DMEM (含GBE浓度分别为0.1、0.01mg/ml),对照组为只含10%FBS的DMEM,分别培养12、24、48、72h后将待测细胞离心-PBS冲洗-固定-离心-冲洗-染色后上机检测,用细胞增殖指数(Proliferation index,PrI)表示相对增殖能力。实验三银杏叶提取物对脂多糖介导下人牙周膜细胞生长及分泌细胞因子的影响。1.观察不同浓度GBE对LPS介导下PDLCs活性的影响。取生长状态良好的第5代人PDLCs,实验分为五组：对照组、LPS组、LPS+0.1mg/mlGBE组LPS+0.01mg/mlGBE组、LPS+地塞米松组。对照组为仅含10%FBS的DMEM, LPS终浓度为100μg/ml,地塞米松终浓度为2μg/ml,分别培养12、24、48、72h后,应用MTT比色法测定各组光密度(Optical density, OD)2.观察不同浓度GBE对LPS介导下PDLCs分泌白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha, TNF-α)水平的影响。取生长状态良好的第5代人PDLCs,实验分为五组：对照组、LPS组、LPS+0.1mg/mlGBE组、LPS+0.01mg/mlGBE组、LPS+地塞米松组。对照组为仅含10%FBS的DMEM培养液,LPS终浓度为100μg/ml,地塞米松终浓度为2μg/ml,分别培养12、24、48、72h后取培养细胞的上清液,保存于-20℃冰箱待检,按酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测试剂盒操作步骤,根据标准品OD值所得标准曲线,换算所测上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。结果：1.原代培养的牙周膜组织块周围7天左右可见有梭形细胞游出。经免疫组化鉴定：抗细胞角蛋白阴性,抗波形丝蛋白阳性。2.①MTT结果表明：1mg/mlGBE组对人PDLCs有一定的抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),0.1mg/mlGBE组在12、24、48h对人PDLCs有促进增殖作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),O.Olmg/mlGBE组在24、48、72h对人PDLCs有促进增殖作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),0.001mg/ml组对人PDLCs促进作用不明显,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。②FCM结果表明：0.1mg/mlGBE组在12、24、48h PrI与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),0.01mg/mlGBE组在24、48、72h PrI与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.①MTT结果表明：LPS在浓度为100μg/ml时明显抑制细胞活性,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),加入0.1、0.01mg/mlGBE后细胞活性明显增强,与LPS组比较差异有统计学意义(p<0.05)。②ELISA结果表明：LPS在浓度为100μg/ml时明显促进人PDLCs分泌IL-6、IL-1β、TNF-α的水平,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),加入0.1、0.01mg/mlGBE均能抑制LPS介导下人PDLCs分泌IL-6、IL-1β、TNF-α的活性,与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.利用改良组织块培养法所培养细胞为来源于中胚层的细胞,而非上皮源性。证明本实验成功培养了人PDLCs,为后续实验奠定基础。2.①不同浓度的GBE对人PDLCs增殖影响不同,1mg/mlGBE抑制人PDLCs增殖,0.1、0.01mg/mlGBE促进人PDLCs增殖并呈浓度依赖性。②0.1、0.01mg/mlGBE促进体外培养人PDLCs增殖时,使G1期细胞减少,S期细胞增加,细胞增殖指数PrI值(S+G2/M)%增高,促进更多的细胞进入增殖状态。3.GBE对LPS抑制人PDLCs活性具有保护作用,并且能抑制LPS介导人PDLCs分泌TNF-α、IL-6、IL-1β水平,提示GBE在抗炎作用方面的作用机制与抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症细胞因子有关。