RNAIII激活蛋白的靶蛋白(target of RNAIII-activiting protein,TraP)是一种由167个氨基酸残基构成的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的膜相联蛋白,其基因序列高度保守。用MseⅠ对traP酶切进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,可将traP分为五个型。但至今未见国内S.aureus分离株traP分型报道。RNAIII激活蛋白(Rap)是33 kDa的分泌到细胞外的自诱导因子,可以调节TraP的三个保守组氨酸残基发生磷酸化,并调节S.aureus致病作用。但是到目前为止,TraP与Rap能否发生直接作用未见报道。为了解我国S.aureus分离株的traP基因分型和变异情况,本实验用PCR方法扩增了分离于奶牛乳房炎的26株S.aureus和4株参考菌株的traP基因,并进行测序和分析。结果,30株S.aureus的traP基因同源性可达到85.5%以上;基于MseⅠ酶切位点的RFLP分析可以将30株S.aureus划归为4个traP型,其中traPⅠ型13株,traPⅡ型2株,traPⅢ型14株,traPⅤ型1株,无traPⅣ型菌株。为确定TraP和Rap能否直接作用,本实验表达并纯化了TraP蛋白和Rap蛋白,用重组TraP蛋白免疫小白鼠制备抗TraP多克隆抗体血清。首先,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA),对包被的全菌体表面的TraP蛋白进行检测,初步证实TraP蛋白暴露于S.aureus表面。然后,通过双夹心ELISA法、串联亲和纯化法和琼脂双向双扩散试验在体外检测TraP蛋白和Rap蛋白的直接结合情况。结果显示,在体外实验中TraP蛋白和Rap蛋白可以结合。在此基础上,为了定位TraP蛋白与Rap蛋白作用的位点,分别用DNAStar的Protean软件和SWISS-PORT网站分析了TraP蛋白的二级结构,用SWISS-MODEL的同源建模的简捷模式预测TraP蛋白和Rap蛋白的三级结构,然后用噬菌体展示方法分别研究可能与TraP蛋白和Rap蛋白相互作用的肽段,再通过截短突变和定点突变的方法改变TraP蛋白的氨基酸残基,定位TraP蛋白与Rap蛋白的结合位点。最终将TraP蛋白与Rap蛋白的结合位点定位在TraP蛋白氨基酸序列的Ser-75和Thr-76。本实验为进一步研究由TraP蛋白和Rap蛋白介导的信号转导途径、TraP蛋白和Rap蛋白相关的S.aurues致病机理和防止S.aureus感染的疫苗及靶向药物提供参考。