论文部分内容阅读
莱姆病(Lyme disease，LD)，也称莱姆疏螺旋体病(Lyme Borreliosis)，是一种蜱传感染性人兽共患病。莱姆病螺旋体可引起人体多系统、器官的损害，典型症状为游走性红斑(erythema migrans，EM)，后期可侵犯关节、心脏和神经系统，严重者终生致残甚至死亡。莱姆病早期经抗生素治疗后容易治愈，但若未及时治疗而侵犯多系统会致残甚至死亡。因此，提高早期诊断能力及开发有效的疫苗成为莱姆病防治的关键和研究热点。 本研究中，我们对59株莱姆病螺旋体的5种重要蛋白抗原(41KD鞭毛蛋白、BmpA、P83/100、P66和OppA2)的编码基因序列及其人B细胞抗原表位序列的多态性进行研究。同时，我们将对中国阿弗西尼疏螺旋体基因型代表菌株FP1的ospC基因克隆表达，并对其免疫保护性进行初步研究。为研制莱姆病的早期诊断试剂和多价亚单位疫苗提供基础。 本研究经过对相关基因的PCR扩增、测序和数据比对分析，我们获得了41KD鞭毛蛋白、BmpA、P83/100、P66和OppA25种蛋白抗原编码基因的序列多态性数据。首先，根据每个蛋白氨基酸序列的聚类结果中，狭义伯氏疏螺旋体(B.b.s.s)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)和阿弗西尼疏螺旋体(B.afzelii)三个基因型菌株分别聚类为3个簇(cluster)，与之前的分型结果基本一致;其中，阿弗西尼疏螺旋体基因型菌株在基因型内较保守，伽氏疏螺旋体基因型菌株的变异具有明显的亚簇聚类，分别为亚簇2(subcluster2)和亚簇3(subcluster3)。在bmpA基因的聚类结果中，JC1-7菌株的聚类群发生改变，由伽氏疏螺旋体基因型改变为阿弗西尼疏螺旋体基因型，这种现象提示在bmpA基因中可能存在基因水平转移事件的发生。另外，阿弗西尼疏螺旋体基因型菌株的p83/100基因在429-458aa位置存在30个氨基酸的缺失，其中含有一个人B细胞抗原表位;伽氏疏螺旋体基因型的15株新疆分离株的P66基因在508aa位置由CAA突变为TAA，导致这15株菌株中P66复制表达提前终止。阿弗西尼疏螺旋体基因型4株分离株的P66基因在1523bp处插入一个碱基A和一个碱基C，导致其氨基酸序列在511aa终止。 本研究成功构建重组质粒pET-30a-OspC并在宿主菌内高效表达;Westernblot结果表明rOspC与莱姆病螺旋体FP1的多克隆抗体有明显的抗原抗体反应; rOspC免疫兔血清的IgG效价显著升高(1∶3200或1∶6400);体外中和试验表明实验组的免疫兔血清均能中和106个/ml的莱姆病螺旋体。 我们研究了中国莱姆病螺旋体5种主要蛋白抗原编码基因及其人B细胞抗原表位多态性，结果表明存在较明显的基因型间多态性。本研究中，41KD鞭毛蛋白在基因型内较保守，其余4种蛋白均存在变异，特别是伽氏疏螺旋体基因型内多态性更加显著。为提高诊断灵敏度和高效疫苗保护力，在研发过程中我们要考虑各基因型间以及伽氏疏螺旋体基因型内的变异性。阿弗西尼疏螺旋体基因型菌株中p83/100基因的30个氨基酸缺失可作为分型的一个标志。同时，我们成功的克隆表达了阿弗西尼疏螺旋体OspC蛋白，并证实重组OspC具有良好的免疫保护性。