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研究背景钙化性主动脉病（CAVD）是一种常见于老年人的心脏瓣膜疾病。CAVD中瓣膜病理变化主要表现为瓣膜钙化和纤维化。主动脉瓣间质细胞作为构成主动脉瓣的主要细胞,在CAVD的发生与发展中起关键作用。大量研究表明,主动脉瓣间质细胞中的炎症反应通过增强细胞的成骨成纤维反应,促进主动脉瓣钙化纤维化。病变的瓣膜组织中发现大量单核细胞浸润,提示单核细胞参与CAVD的发生发展。目前已知单核细胞通过引起血管炎症在动脉粥样硬化的发生发展中起到关键作用,但单核细胞和主动脉瓣间质细胞之间的交互作用尚不清楚。我们推测:单核细胞可增强主动脉瓣间质细胞炎症反应并促进其成骨成纤维反应。本研究通过研究单核细胞和主动脉瓣间质细胞之间的交互作用以及其中涉及的分子机制,为寻找新的针对CAVD的治疗靶点提供理论和实验依据。第一部分单核细胞通过旁分泌作用增强主动脉瓣间质细胞炎症反应目的研究激活的单核细胞对调节主动脉瓣间质细胞炎症反应的作用,以及潜在的分子机制。方法1.主动脉瓣间质细胞与单核细胞共培养:主动脉瓣间质细胞和单核细胞按1:3的比例共培养,并加入Pam3CSK4处理细胞。主动脉瓣间质细胞与单核细胞一同裂解后,通过免疫印迹检测ICAM-1和VCAM-1表达水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养基中MCP-1含量。通过免疫荧光检测定位主动脉瓣间质细胞和单核细胞中ICAM-1的表达。2.条件培养基制备:条件培养基取自培养单核细胞的细胞培养基。其中:使用Pam3CSK4（0.1μg/ml）处理的称为Pam3条件培养基（Pam3 CM）,未经处理的称为对照条件培养基（Ctrl CM）。3.使用条件培养基处理主动脉瓣间质细胞并检测其炎症反应:使用Pam3条件培养基、对照条件培养基和Pam3CSK4（0.03 μg/ml）处理主动脉瓣间质细胞。使用免疫印迹检测ICAM-1、VCAM-1、MyD88以及TLR2表达水平。使用ELISA检测培养基中MCP-1含量。使用免疫荧光检测TLR2表达水平。4.拮抗或沉默TLR2:使用TLR2拮抗剂CU CPT 22预处理主动脉瓣间质细胞,再使用Pam3条件培养基处理细胞。使用慢病毒转染TLR2 shRNA,再使用Pam3条件培养基处理细胞。使用免疫印迹检测TLR2、ICAM-1和VCAM-1表达水平。使用ELISA检测培养基中MCP-1含量。5.细胞因子以及趋化因子检测:使用定量多重ELISA阵列（Quantitative Multiplex ELISA Arrays）检测Pam3条件培养基和对照条件培养基中18种炎症因子的含量。6.TNF-α中和试验:使用TNF-α中和抗体预处理Pam3条件培养基。再使用处理后的Pam3条件培养基处理细胞。使用免疫印迹检测TLR2、ICAM-1和VCAM-1表达水平。7.验证TNF-α促炎作用:使用TNF-α重组蛋白处理主动脉瓣间质细胞。使用免疫印迹检测TLR2、ICAM-1以及VCAM-1表达水平。结果1.TLR2激动剂Pam3CSK4（0.03μg/ml）仅在主动脉瓣间质细胞与单核细胞共培养时可诱导其表达高水平ICAM-1和VCAM-1,并增加MCP-1分泌。2.使用Pam3条件培养基处理主动脉瓣间质细胞,可以使主动脉瓣间质细胞表达高水平的ICAM-1和VCAM-1,并增加MCP-1的分泌。3.TLR2拮抗剂可抑制Pam3条件培养基引起的主动脉瓣间质细胞中ICAM-1、VCAM-1以及MCP-1的表达上调。4.Pam3条件培养基可以导致主动脉瓣间质细胞中TLR2升高。通过抑制TLR2升高,可以部分降低Pam3条件培养基引起的主动脉瓣间质细胞ICAM-1与VCAM-1表达水平上升。5.Pam3条件培养基中含有较高水平的TNF-α,通过中和Pam3条件培养基中的TNF-α,能显著降低Pam3条件培养基引起的主动脉瓣间质细胞TLR2水平的上调。同时也部分降低了 Pam3条件培养基引起的ICAM-1与VCAM-1的上调。6.TNF-α可以上调主动脉瓣间质细胞中TLR2水平,但不能引起ICAM-1与VCAM-1的上调。结论1.激活的单核细胞通过旁分泌炎症因子,调节主动脉瓣膜间质细胞的炎症反应。2.激活的单核细胞分泌TNF-α上调主动脉瓣间质细胞中TLR2水平,增强主动脉瓣间质细胞对炎症刺激的应答。第二章单核细胞通过炎症因子促进主动脉瓣膜间质细胞成骨及成纤维反应目的本研究的目的是探究激活的单核细胞对主动脉瓣间质细胞钙化纤维化的影响,并明确其中潜在的分子机制。方法1.条件培养基制备:与第一章中条件培养基制备方法相同。2.检测主动脉瓣间质细胞胶原产生和钙沉积:Pam3条件培养基处理主动脉瓣间质细胞14日后,使用Picro-Sirius red染色检测胶原产生。主动脉瓣间质细胞在促成骨培养基中经Pam3条件培养基处理10日后,使用Alizarinred S染色以检测钙沉积。3.使用条件培养基处理主动脉瓣间质细胞检测其成纤维和成骨反应:Pam3条件培养基处理主动脉瓣间质细胞,使用免疫印迹检测collagen-Ⅰ、collagen-Ⅳ、MMP-2、MMP-9、ALP 以及 BMP2 的水平。4.检验TNF-α以及RANTES在Pam3条件培养基中的作用:使用TNF-α或RANTES中和抗体预处理Pam3条件培养基,中和抗体处理后的Pam3条件培养基处理主动脉瓣间质细胞。通过免疫印迹检测collagen-Ⅰ、MMP-2和ALP表达水平。5.检测MAP kinase以及NF-κB信号通路的激活:使用Pam3条件培养基处理主动脉瓣间质细胞,使用免疫印迹检测p38、ERK1/2、JNK以及NF-κB的磷酸化水平。使用TNF-α和/或RANTES中和抗体预处理Pam3条件培养基,处理后的Pam3条件培养基处理主动脉瓣间质细胞。使用免疫印迹检测p38、ERK1/2、JNK以及NF-κB的磷酸化水平。6.验证JNK和NF-κB信号通路作用:SP600125以及Bay11-7082分别处理主动脉瓣间质细胞,再使用Pam3条件培养基处理细胞,通过免疫印迹检测collagen-Ⅰ、MMP-2 和 ALP 表达水平。结果1.Pam3条件培养基增加主动脉瓣间质细胞胶原蛋白沉积以及钙沉积。2.Pam3条件培养基可以上调主动脉瓣间质细胞中成骨介质ALP;纤维介质collagen-Ⅰ和MMP-2的表达水平。3.Pam3条件培养基中具有高水平的TNF-α和RANTES。中和Pam3条件培养基中的TNF-α,减弱Pam3条件培养上调ALP、collagen-Ⅰ和MMP-2表达的作用。中和Pam3条件培养基中的RANTES,减弱Pam3条件培养基上调collagen-Ⅰ和MMP-2表达的作用。4.Pam3条件培养基诱导了 NF-κB和MAP kinase信号通路的激活。通过中和Pam3条件培养基中的TNF-α,抑制其引起的NF-κB与JNK信号通路激活。通过中和Pam3条件培养基中的RANTES,抑制其引起的JNK信号通路激活。5.在主动脉瓣间质细胞中,NF-κB信号通路介导了Pam3条件培养基引起的ALP表达上调。JNK信号通路介导了 Pam3条件培养基引起的collagen-Ⅰ和MMP-2表达上调。结论1.Pam3条件培养基通过诱导主动脉瓣间质细胞成骨和成纤维介质产生促进其钙化纤维化反应。2.在Pam3条件培养基中,TNF-α通过NF-κB通路的激活介导主动脉瓣间质细胞中成骨介质的产生3.TNF-α和RANTES通过JNK信号通路的激活诱导的主动脉瓣间质细胞中成纤维介质的上调。