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肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）作为原发性肝癌中最常见的类型,也是我国最常见的恶性肿瘤之一。放疗作为HCC的主要治疗手段之一,在临床上已得到广泛的应用。但在实际治疗中,常因肿瘤体积较大以及乏氧组织的存在而导致辐射敏感性受到影响。微小RNA（micro RNA,miRNA）通过与靶基因3’UTR结合而调节靶基因的表达,进而参与多种生物过程,包括细胞增殖、凋亡、转移、侵袭,放化疗敏感性等。研究报道称miR-138-5p在肝癌,宫颈癌,骨肉瘤,非小细胞肺癌等不同的恶性肿瘤中呈现低表达状态,并通过调控不同靶基因表达而发挥抑癌作用。然而,miR-138-5p对HCC的辐射敏感性的影响研究尚未见报道。Zeste同源基因增强子2（Enhancer of zeste homolog 2,EZH2）作为一种组蛋白甲基酶,通过催化H3K27me3抑制基因表达。生物信息学分析显示EZH2为miR-138-5p靶基因之一。作为两种不同的表观遗传学调控途径,miR-138-5p及EZH2对于肝癌细胞辐射敏感性的影响仍值得进一步探讨。因此,本研究拟探讨miR-138-5p/EZH2轴在肝癌细胞辐射敏感性中的调控作用,将对提高HCC的放疗疗效提供实验依据和思路。目的:观察miR-138-5p及EZH2对肝癌细胞辐射后细胞克隆形成能力,增殖能力,凋亡,细胞周期阻滞以及细胞迁移侵袭能力的影响;验证miR-138-5p与EZH2之间的靶向调控关系;探讨miR-138-5p/EZH2调控轴对肝癌细胞辐射敏感性影响及作用机制。方法:1.利用生物信息学方法分析miR-138-5p和EZH2在不同分期肝癌组织中表达情况,以及二者对于肝癌患者生存期影响。2.通过转染miR-138-5p mimic构建miR-138-5p过表达细胞模型,利用慢病毒质粒转染方法构建Hep G2-EZH2LOW细胞模型,利用RT-q PCR以及Western blot法验证模型构建是否成功。利用克隆形成实验检测细胞辐射敏感性,利用MTT实验检测细胞增殖能力,利用流式细胞术检测细胞周期阻滞及凋亡情况,利用细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞迁移能力和侵袭能力,Western blot检测相关蛋白表达变化。3.通过双荧光素酶报告实验与染色质免疫共沉淀分析实验证明miR-138-5p及EZH2二者之间的双向调控关系。结果:1.miR-138-5p与肝癌患者疾病分期及生存期关系通过在线分析网站进行生物信息学分析结果显示,miR-138-5p的前体miR-138-1在肝癌组织中处于低表达状态,并且在不同分期的肝癌患者体内的表达水平均较低。miR-138-5p基础表达水平较高的患者生存期明显优于基础表达较低者（P＜0.01）。随后细胞水平验证结果显示肝癌细胞中miR-138-5p的表达水平明显低于正常肝细胞L-02（P＜0.01）。2.miR-138-5p对Hep G2和Hep3B细胞辐射后反应的影响（1）miR-138-5p对Hep G2和Hep3B细胞辐射敏感性的影响细胞克隆形成实验结果显示,两种肝癌细胞的存活分数（surviving fraction,SF）均随着照射剂量的增加而降低。与对照组相比,同种剂量下,过表达miR-138-5p组细胞的SF值明显降低（P＜0.05）。与对照组相比,miR-138-5p过表达组的平均致死剂量D0值与SF2值均降低,说明增加miR-138-5p表达能够增强Hep G2和Hep3B细胞辐射敏感性。（2）miR-138-5p对Hep G2和Hep3B细胞辐射后增殖的影响MTT结果显示:在Hep G2和Hep3B两种肝癌细胞中,与对照组相比,未经照射或经8Gy照射48h及72h后,miR-138-5p过表达组细胞增殖明显被抑制（P＜0.05）。提示miR-138-5p能够引起辐射后两种肝癌细胞的增殖能力的降低。（3）miR-138-5p对Hep G2和Hep3B细胞辐射后周期进程的影响流式细胞术对细胞周期进程检测结果显示,与对照组细胞相比,miR-138-5p过表达组细胞经0Gy处理后24h,G0/G1期百分比明显增加,S期百分比降低（P＜0.01）;在两种肝癌细胞经过8Gy辐射之后24h,与对照组相比,miR-138-5p过表达组细胞G0/G1期百分比明显增加（P＜0.001）,提示发生G0/G1期阻滞。（4）miR-138-5p对Hep G2和Hep3B细胞辐射后凋亡的影响利用流式细胞术检测两种肝癌细胞经辐射及miR-138-5p过表达处理后细胞凋亡情况。结果显示,在两种肝癌细胞中,与对照组细胞相比,miR-138-5p过表达组细胞在经过0Gy或8Gy处理后24h凋亡率明显增加（P＜0.05）。提示miR-138-5p能够促进辐射后肝癌细胞的凋亡。（5）miR-138-5p对Hep G2和Hep3B细胞辐射后迁移,侵袭能力影响利用细胞划痕实验检测两种肝癌细胞辐射前后迁移能力的变化。结果显示,0Gy处理后24h及48h,与对照组相比,miR-138-5p过表达组细胞的迁移能力明显被抑制（P＜0.05）;8Gy处理后的24h及48h,与对照组相比,过表达miR-138-5p组细胞迁移能力也同样明显被抑制（P＜0.05）。提示过表达miR-138-5p后Hep G2及Hep3B细胞辐射前后迁移能力减弱。Transwell小室结果显示,经过0Gy或8Gy处理后,与对照组相比,过表达miR-138-5p组侵袭细胞数显著减少（P＜0.05）,提示miR-138-5p过表达可抑制辐射前后肝癌细胞的侵袭能力。（6）miR-138-5p对Hep G2和Hep3B细胞辐射后EMT标志物的影响利用Western Blot法检测上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）相关标志物E钙粘蛋白（E-cadherin）、N钙粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）以及EMT标志性的转录因子之一SNAIL（snail family transcriptional repressor 1）的蛋白表达。结果显示,在两种肝癌细胞中,经过0Gy或8Gy处理后,与对照组相比,miR-138-5p过表达组细胞中N-cadherin、Vimentin、SNAIL的表达降低。在Hep3B细胞经过0Gy或8Gy处理后,miR-138-5p过表达组E-cadherin蛋白水平升高,在Hep G2细胞中,0Gy处理后miR-138-5p过表达组E-cadherin蛋白水平同样升高,但经8Gy处理后则无明显变化。结果提示过表达miR-138-5p可以抑制辐射前后两种肝癌细胞的EMT进程。3.miR-138-5p对EZH2靶向调控作用的探究利用在线网站对miR-138-5p靶基因进行预测,筛选出miR-138-5p可能与EZH2具有靶向关系。双荧光素酶报告实验结果显示,与对照组相比,miR-138-5p mimic与psi CHECK2-EZH2-3′UTR共转染后可以显著抑制荧光素酶活性（P＜0.05）。与此同时,miR-138-5p mimic或相应的阴性对照与突变型质粒psi CHECK2-EZH2-3′UTR mut共转染后荧光素酶的活性没有发生明显变化。进一步在肝癌细胞中验证结果显示,过表达miR-138-5p后两种肝癌细胞中EZH2的m RNA水平明显降低（P＜0.01）,蛋白水平同样被抑制。提示miR-138-5p与EZH2具有靶向调控关系。4.EZH2与肝癌患者疾病分期及生存期关系通过在线分析网站利用生物信息学分析结果显示,EZH2在肝癌组织中处于高表达水平（P＜0.001）,并且随着肝癌患者分期的增长,EZH2表达水平亦逐渐升高,并且EZH2基础表达水平较高的患者生存期明显比基础表达较低者差（P＜0.001）。随后在细胞水平验证结果显示五种肝癌细胞中EZH2的m RNA水平明显高于L-02（P＜0.01）,蛋白表达水平同样高于L-02。提示EZH2在肝癌组织中明显高表达,与miR-138-5p表达呈相反趋势。5.沉默EZH2对Hep G2细胞辐射后反应的影响（1）沉默EZH2对Hep G2细胞的辐射敏感性的影响细胞克隆形成实验结果显示,沉默EZH2后的Hep G2细胞的SF随着照射剂量的增加而逐渐降低。与转染载体质粒组相比,同种剂量下,沉默EZH2组细胞的SF值明显降低（P＜0.05）。与转染载体质粒组相比,沉默EZH2组的平均致死剂量D0值与SF2值均降低,说明沉默EZH2表达能够增强Hep G2细胞的辐射敏感性,与增加miR-138-5p表达达到的效果趋势相同。（2）沉默EZH2对Hep G2细胞的辐射后增殖的影响根据MTT实验的结果显示:在Hep G2细胞中,与转染载体质粒组相比,经0Gy处理48h后,沉默EZH2组细胞增殖明显被抑制（P＜0.05）。经8Gy照射后72h,沉默EZH2组增殖抑制效果显著（P＜0.05）。提示沉默EZH2能够引起辐射前后Hep G2的增殖能力的降低。（3）沉默EZH2对Hep G2细胞的辐射后周期进程及凋亡的影响对细胞周期进程检测结果显示,与转染载体质粒组相比,沉默EZH2组细胞经0Gy处理后24h,G0/G1期百分比降低,G2/M期百分比增加（P＜0.05）;在经过8Gy辐射之后24h,与转染载体质粒组相比,沉默EZH2组细胞G0/G1期百分比明显增加（P＜0.05）,提示发生G0/G1期阻滞。检测凋亡结果显示,与0Gy组相比,经过8Gy辐射后,各组细胞凋亡率均增加。与转染载体质粒组相比,沉默EZH2组细胞在经过0Gy或8Gy处理后24h凋亡率明显增加（P＜0.05）。提示沉默EZH2组能够促进辐射引起的肝癌细胞的凋亡,这与过表达miR-138-5p达到的作用趋势一致。（4）沉默EZH2对Hep G2细胞辐射后迁移,侵袭能力及EMT标志物的影响细胞划痕实验结果显示,0Gy或8Gy处理后24h及48h,与转染载体质粒组相比,沉默EZH2组细胞的迁移能力明显被抑制（P＜0.05）。Transwell实验结果显示,经过0Gy或8Gy处理后,与转染载体质粒组相比,沉默EZH2组细胞侵袭细胞数显著减少（P＜0.001）,提示沉默EZH2与过表达miR-138-5p后对肝癌细胞辐射前后迁移能力的影响作用一致。随后对EMT相关标志物蛋白表达水平检测结果显示,在经过0Gy或8Gy处理后,与转染载体质粒组相比,沉默EZH2组细胞中N-cadherin、Vimentin、SNAIL的表达降低。以上结果提示在肝癌细胞中,miR-138-5p可通过靶向EZH2增强肝癌细胞辐射敏感性及抑制迁移侵袭等能力。6.EZH2通过H3K27me3对miR-138-5p表达的影响我们的结果显示,在Hep G2细胞中沉默EZH2表达后,miR-138-5p的表达水平明显升高（P＜0.01）,而在Hep3B细胞中过表达EZH2之后,miR-138-5p的表达水平明显被抑制（P＜0.01）。染色质免疫共沉淀分析（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）结果显示,与转染载体质粒组相比,Hep G2沉默EZH2后细胞中miR-138-5p启动子部分区域的H3K27me3富集水平明显降低。提示在肝癌细胞中EZH2可通过介导miR-138-5p启动子区域H3K27me3修饰调控miR-138-5p的表达,提示miR-138-5p与EZH2之间存在相互抑制的反馈调控机制。结论:1.miR-138-5p可增强肝癌细胞辐射敏感性,抑制辐射后细胞增殖,促进凋亡,通过影响EMT进程而影响肝癌细胞辐射后迁移侵袭能力。2.抑制EZH2可使肝癌细胞辐射敏感性升高,肝癌细胞辐射后凋亡增多,增殖能力降低,同时,使辐射后肝癌细胞迁移侵袭能力受到抑制。3.miR-138-5p与EZH2之间通过相互抑制的调控机制形成反馈轴,共同调控肝癌细胞辐射敏感性及迁移侵袭等能力。