鲫鲤杂交鱼精巢转录组测序及减数分裂相关基因的研究

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鲫鲤杂交鱼源自雌性红鲫(Carassius auratus red var.,(?),2n=100,RCC)与雄性鲤(Cyprinus carpio,(?),2n=100,CC),它能突破子代F1生殖难关产生可育的杂交品系。鲫鲤杂交鱼为杂交子代,由异源染色体组组成的生殖细胞经历较长时间的减数分裂阻滞期,该过程中相关减数分裂基因的功能表达情况直接关系到其是否能跨越生殖障碍,这是解析远缘杂交突破生殖隔离及多倍体发生分子机制的关键切入点。本论文以非繁殖季节二倍体鲫鲤F1(2n=100,JLF1)及其两性可育母本二倍体红鲫为实验研究材料,在精巢转录组测序的基础上,对其减数分裂相关基因进行分析,结合精巢组织学显微结构观察,采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对关键基因的表达进行验证,分析相关基因的表达差异和减数分裂形态的关联性。主要研究内容如下:1.本研究通过Illumina平台对红鲫和鲫鲤F1精巢进行转录组测序,红鲫的三个精巢组织分别产生了69672536、66862654和53529812个clean reads,鲫鲤F1的三个精巢组织分别产生了58924616、67070840和61212184个clean reads。对clean reads进行拼接后,得到47743个基因。FPKM定量结果表明,红鲫的整体基因表达水平比鲫鲤F1高。DEseq分析发现,红鲫和鲫鲤F1中差异表达基因数为1843个,其中上调522个,下调1321个。通过GO富集分析,1245个差异表达基因被注释到2260个GO条目上,在生物过程、细胞组成、分子功能三个分类中,分别有772个、474个、1044个差异表达基因表达。通过KEGG富集分析,820个差异表达基因被标注到了122个KEGG信号通路上,其中最显著的6条通路分别是孕酮介导卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation),细胞周期(Cell cycle),卵母细胞减数分裂(Oocyte meiosis),p53信号通路(p53signaling pathway),细胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs),泛素介导蛋白水解(Ubiquitin mediated proteolysis)信号通路。利用GO和KEGG数据库对注释的基因进行分类,筛选出10个重要的与减数分裂、细胞周期、性腺分化等过程相关的候选基因。2.为了解析杂交鱼减数分裂异常特征,本研究通过组织切片技术对杂交鱼精巢显微结构进行观察。结果表明,鲫鲤F1可育个体需要发育两年才能突破生殖阻滞,达到性成熟;其中,少量雄性个体经过延迟的生殖细胞发育程序,形成成熟的精子;绝大部分雄性个体不能正常发育,可观察到精原细胞(SPG)、初级精母细胞(PS)、凋亡细胞(AP),但其生殖细胞较长时间被抑制在第一次减数分裂中期和后期。3.为了验证减数分裂相关基因的表达,本论文从转录组差异表达基因中挑选了8个参与调控减数分裂过程的关键基因(Sun1,Rec8,Sycp3,Mlh1,Spo-11,Rad51,Dmc1,Smc5/6)和2个参与细胞周期调控基因(Cdc2,Cyclin B)进行qRT-PCR分析。结果表明,红鲫和鲫鲤F1精巢差异基因的表达趋势与RNA-seq定量结果一致,并且以上10个基因表达水平在鲫鲤F1精巢中均比红鲫更高,这是因为红鲫精巢在减数分裂过程中不受阻滞,极易发育为成熟的精子,导致在相同体积组织中精母细胞数相对较少;而在非繁殖季节鲫鲤F1的精巢组织中,绝大部分生精细胞都被阻滞积累在第一次减数分裂前期和中后期,导致减数分裂关键基因和细胞周期基因表达更丰富。本研究通过对鲫鲤杂交鱼减数分裂相关基因的转录组数据进行分析,探讨了鲫鲤F1精巢组织在减数分裂阻滞过程中的相关基因表达特征,不仅为鲫鲤杂交鱼突破生殖难关提供重要的分子学依据,而且在鱼类远缘杂交研究和遗传育种方面具有重要指导意义。
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