研究背景:多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）是成人中最常见且恶性程度最高的颅内肿瘤,其5年生存率不到10%。尽管在开发GBM患者的新治疗策略方面取得了巨大的进展,但对标准化疗药物替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）的耐药和抵抗被认为是GBM治疗失败的重要因素之一。目前临床上也缺乏有效的克服TMZ耐药的措施或手段。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）在多种恶性肿瘤的发生发展和化疗抵抗中发挥重要的调控作用,有望成为潜在的治疗靶标。本研究以复发GBM和原发GBM组织作为研究对象,寻找在GBM复发耐药中发挥关键作用的lncRNA,并在细胞和分子水平上分析其对GBM细胞增殖、凋亡和TMZ获得性耐药等的影响和作用机制,以期为探索TMZ获得性耐药的新的分子机制和新的治疗策略提供理论依据。方法:1.目标lncRNA和mRNA的选择:对3例原发性GBM组织与3例复性发GBM组织进行全转录组测序和生物信息学分析,筛选在复发性GBM中差异表达且与患者的预后有关的mRNA及其上游的lncRNA;通过q RT-PCR、Western blot验证其在组织中的表达。2.目标lncRNA对GBM细胞生物学功能的影响研究:构建TMZ耐药性细胞株,并使用CCK8法检测IC50及耐药倍数;通过q RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测目标分子在TMZ耐药细胞及敏感细胞的表达;在耐药细胞中敲低目标lncRNA的表达,在敏感细胞中过表达lncRNA的表达,通过CCK8、平板克隆、Transwell、流式细胞术检测目标lncRNA表达变化对细胞生物学功能的影响。3.目标lncRNA促进GBM细胞增殖和耐药性的分子机制研究:通过生物信息学分析构建lncRNA的ce RNA网络,并对lncRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析;采用FISH技术检测lncRNA MSTRG.65777.2在GBM细胞中的定位,双荧光素酶报告基因实验来验证lncRNA与miRNA-877-3p的相互作用;通过Western blot检测lncRNA表达改变对GBM细胞中GPR68以及ERK/p ERK表达量的影响。结果:1.与原发性GBM组织相比,共在复发性GBM组织中检出718个异常表达的lncRNA和293个差异mRNA。分析TCGA数据库中GBM患者的测序数据,发现GPR68在复发性GBM中高表达且与患者不良预后有关;共表达分析发现lncRNA MSTRG.65777.2与GPR68表达高度相关,可能是调控GPR68的上游lncRNA;q RT-PCR、Western blot结果证实GPR68和lncRNA MSTRG.65777.2在复发GBM中高表达。2.lncRNA MSTRG.65777.2和GPR68在TMZ耐药细胞株中表达水平显著高于亲本细胞;CCK8、平板克隆、Transwell结果显示lncRNA MSTRG.65777.2的表达促进了GBM细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。流式细胞术表明沉默lncRNA MSTRG.65777.2促进了细胞的凋亡,并将细胞周期阻滞于G1/S期。3.FISH结果表明lncRNA MSTRG.65777.2主要位于细胞质中,双荧光素酶分析验证了lncRNA MSTRG.65777.2与miRNA-877-3p之间的相互作用和结合位点;Western blot结果显示lncRNA MSTRG.65777.2的敲低或过表达能够降低或增高GPR68的表达水平,且可以影响ERK蛋白的磷酸化水平。结论:本研究发现了一种与GBM耐药复发相关的新的lncRNA MSTRG.65777.2,其在复发性GBM组织和对TMZ耐药的GBM细胞中高表达,可能是作为ce RNA吸附结合miRNA-877-3p调控GPR68的表达,进而激活ERK信号通路,最终导致GBM细胞的增殖、侵袭和对TMZ的耐药性。