背景与目的NK/T 细胞淋巴瘤（Natural killer/T cell lymphoma,NKTCL）是一种罕见的高度侵袭性的淋巴瘤亚型,好发于亚洲及南美洲人群,其恶性程度高,预后差,与Epstein-Barr virus（EBV）感染密切相关,但具体发病机制仍待进一步阐明。此外,根据原发病灶解剖部位的不同,NKTCL分为上呼吸消化道原发NKTCL（upper aerodigestive tract,UAT-NKTCL）和非上呼吸消化道原发 NKTCL（non-upper aerodigestivetract,NUAT-NKTCL）两种临床亚型。其中,超过 80%的 NKTCL 属于UAT-NKTCL亚型,其主要累及鼻腔及其邻近区域,常见首发症状有鼻塞、流涕、鼻出血等,极易误诊为鼻部炎性疾病。此外,NUAT-NKTCL仅占NKTCL的10-20%,但该亚型临床表现多样,常侵犯皮肤、胃肠道、睾丸等,其恶性程度更高,预后更差。尽管目前对于该疾病的诊治取得很大进步,但是由于该疾病发病初期缺乏特异的临床表现,常常导致患者不能得到及时的诊断与治疗。在人类的鼻腔中栖息着复杂的微生物群体,并且致病菌定植于上呼吸道是后续发生侵袭性疾病的重要前提。近年来,随着高通量测序技术的发展,大量研究表明人体微生物与人体的免疫、炎症、代谢等生理病理过程密切相关,并在恶性肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病以及神经退行性疾病等多种疾病的发生发展中扮演重要角色,其中,幽门螺杆菌感染与胃黏膜相关组织边缘区淋巴瘤之间的关系更是构成了微生物驱动恶性肿瘤发生发展的范例。值得注意的是,越来越多的研究指出鼻腔菌群失调与慢性鼻-鼻窦炎（chronic rhinosinusitis,CRS）、哮喘、肉芽肿性多血管炎等疾病密切相关,进一步表明了鼻腔菌群在人类的健康与疾病中具有重要作用。然而,目前关于人体鼻腔微生物与NKTCL发生发展之间关系的研究十分有限,因此揭示NKTCL患者的鼻腔菌群特点,对进一步探索鼻腔微生物在NKTCL发生发展中的作用及其潜在临床应用价值将具有十分重要的意义。通过本研究,我们旨在:①初步揭示NKTCL患者的鼻腔菌群特点;②评估鼻腔菌群在NKTCL患者临床诊疗中的价值;③为今后进一步阐明NKTCL的发病机制提供新的思路。材料与方法入组人群:分别于郑州大学第一附属医院肿瘤科和鼻科采用无菌植绒拭子采集NKTCL患者（NKT组,n=46）、慢性鼻-鼻窦炎患者（CRS组,n=25）的鼻前孔菌群样本,其中所有NKTCL患者的诊断均经我院至少2名病理科医师病理诊断证实,排除标准包括:①除NKTCL以外,患有其他类型恶性肿瘤;②近2周内应用抗生素、益生菌和益生元等明显影响人体微生物组成的药物或制剂;③临床信息不完整;④拒绝签署知情同意书。依据PET/CT、CT或MRI检查来确定肿瘤原发部位,同时收集采样时患者的临床基线资料,包括:性别、年龄、体重、身高、吸烟史、既往疾病史、B症状、临床分期、ECOG评分、PINK-E评分、血常规、血生化、血浆EBV和乳酸脱氢酶水平。所有慢性鼻-鼻窦炎患者均接受鼻窦CT或MRI和鼻内镜检查,并经鼻科副高及以上职称医师做出慢性鼻-鼻窦炎的诊断而无其他鼻咽部恶性疾病。健康对照（healthycontrols,HC组,n=24）来自于本院健康体检者,既往无恶性肿瘤、急慢性鼻部炎症病史。本研究依据世界医学协会伦理规范进行,并经郑州大学第一附属医院伦理审查委员会批准,所有参与本研究的受试者均表示知情同意并签署知情同意书。采样方法:采样方法主要按照《人类微生物组计划操作手册》中的步骤进行（https://www.hmpdacc.org/hmp/doc/HMPMOPVersion120072910.pdf）,样本采集后置于不含酶的2ml无菌管,并立即置于4℃冰盒中运送,于20min内送至-80℃超低温冰箱冻存直至DNA提取。DNA提取:按照说明书要求,采用Swab Genomic DNA Kit（BGI-LH-302-03,中国）试剂盒提取DNA。16S 核糖体 RNA V4 区测序:利用 515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和 806R（5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）作为 PCR 扩增引物进行 V4区细菌16S核糖体RNA基因扩增。扩增基于Illumina HiSeq 2500平台,根据标准的Illumina流程产生2 × 250 bp的双端序列。测序数据处理:对下机数据进行质控过滤,剩余高质量的Clean data用于后期分析;通过reads之间的重叠关系将reads拼接成Tags;将Tags聚类成操作分类单元（OTUs）并与数据库比对、物种注释;基于OTUs和注释结果进行样品物种多样性分析,组间物种差异分析,关联分析与模型预测等下游分析。统计分析及可视化:OTUs的Venn图用R包“Venn diagram”v3.1.1绘制;在OTU 水平上通过 MOTHUR（v1.31.2）和 QIIME（v1.8.0）来分别计算 alpha和 beta多样性;利用LEfSe进行聚类以及线性判别分析（LDA）;基于Wilcoxon检验R（v3.4.1）来确定显著的差异物种或功能;采用R包“randomForest”（v4.6-14）,“caret”（v6.0-90）构建鉴别诊断模型;利用R包“pROC”（v1.18.0）绘制ROC曲线;利用PICRUSt软件对KEGG功能进行预测;使用两组间的Wilcoxon秩和检验（除非另有说明）来比较连续性变量,采用Fisher精确检验比较分类变量;利用受试者工作特征（Receiver operating characteristic,ROC）曲线,并以曲线下面积（area under the curve,AUC）表示ROC效应;P＜0.05认为差异有统计学意义。结果基本信息 本研究共包括95人,其中NKT组46人,CRS组25人,HC组24人,组间基本信息相匹配,年龄、性别、吸烟史和体质指数（bodymass index,BMI）组间无统计学差异。通过稀疏分析表明在每个样本中所观察到的物种基本达到了饱和,说明本研究样品的测序深度足够,仅有很少的物种未被检测到。除此之外,本研究共发现了 2105个OTU,其中NKT组独有314个OTU,NKT组与CRS组共有1248个OTU,三组共有的OTU有992个。NKTCL患者、CRS患者和健康个体鼻腔菌群的生物多样性特点 α多样性反映每个样本内部物种的多少、丰度和均匀程度,常用指标有ACE,Chao1,Shannon和Simpson指数。与CRS组和HC组相比,NKT组拥有最低的ACE（NKT vs CRS,P=0.0481;NKT vs HC,P＜0.001;t test）和 Chao 1（NKT vs CRS,P=0.0353;NKT vs HC,P=0.0023;,test）指数,但是 Shannon 和 Simpson 指数两组间比较无统计学差异。此外,CRS组和HC组相比,以上四种α多样性指标均未见显著差异。β多样性是对不同样本之间的微生物群落构成进行比较,通常采用weighted UniFrac和unweighted UniFrac等算法计算任意两个样本间的距离,若两个群体的β多样性值差异越小,则说明两个群体的物种组成越相似。结果显示,与CRS组和HC组相比,NKT组的β多样性最高,反映出NKTCL患者的鼻腔菌群具有较高的异质性。NKTCL患者鼻腔微生物的系统发育特征 在门水平上,NKT、CRS和HC三组最主要的物种包括厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）以及梭杆菌门（Fusobacteria）。与CRS组相比,NKT组中的变形菌门相对丰度显著降低（P=0.009815）,同时在属水平上,10种菌属包括差异球菌属（Alloiococcus）、莫拉克斯氏菌属（Moraxella）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）等菌属丰度亦显著降低（P值均小于0.05）;另外,与健康个体相比,NKT组放线菌门丰度显著降低（P＜0.001）而厚壁菌门丰度显著升高（P=0.048438）,同时5种菌属包括棒状杆菌属（Corynebacterium）、差异球菌属和丙酸杆菌属等菌属丰度显著降低而葡萄球菌属（Staphylococcus）、普氏菌属（Prevotella）丰度显著升高（P值均小于0.05）,有趣的是,从HC组到CRS组再到NKT组,葡萄球菌属的丰富度逐渐升高,尽管CRS组与其余两组并无统计学差异。此外,与HC组相比,CRS组中的变形菌门丰度显著升高（P=0.007585）,然而棒状杆菌属丰度显著降低（P＜0.001）。NUAT-NKTCL患者独特的鼻腔菌群特点 与UAT-NKTCL相比,NUAT-NKTCL患者组具有较高的ACE指数（P=0.00323）以及更低的weighted UniFrac距离（P＜0.001）,但是两组间 Chao1,Shannon,Simpson 指数和unweighted UniFrac距离均无显著差异。在门水平上,NUAT-NKTCL患者组表现出更高丰度的厚壁菌门（P=0.041497）。此外,我们使用LEfSe方法展示了UAT-NKTCL与NUAT-NKTCL两组间鼻腔菌群的标志物种,即与UAT-NKTCL患者相比,在NUAT-NKTCL 患者鼻腔菌群中,有包括Rhodobacteraceae,Rhodobacterales,Paracoccus等的16种微生物的丰度显著升高,另有包括Porphyromonas,Morganella等4种微生物的丰度显著降低。潜在的UAT-NKTCL微生物诊断标志物 基于UAT和CRS两组间属水平上Top20相对丰富的差异菌,应用随机森林机器学习算法构建用于区分两组的鉴别诊断模型,这11种差异鼻腔微生物包括:Alloiococcus,Escherichia,Propionibacterium,Moraxella,Pelomonas,Morganella,Pseudomonas,Chryseobacterium,Peptoniphilus,Anaerococcus,Finegoldia,并且这些菌属联合得到了曲线下面积为0.975（95%CI:0.906-1.0）的组间鉴别诊断模型。同样地,UAT 和 HC 两组间的 9 种差异菌属包括:Propionibacterium,Alloiococcus,Corynebacterium,Peptoniphilus,Staphylococcus,Porphyromonas,Prevotella,Anaerococcus,Veillonella,这些物种联合构建出了曲线下面积为0.938（95%CI:0.796-1.0）的组间鉴别诊断模型。鼻腔菌群与NKTCL患者的疾病状态和预后指标的关系 当评估鼻腔菌群的α多样性指数与NKTCL患者的临床指标之间关系时,我们发现处于疾病缓解状态下的NKTCL患者的α多样性指数与CRS患者以及健康个体更为相似,然而,疾病活动组（Active-NKTCL）与CRS组或HC组相比,其ACE指数（P=0.00051,Active-NKTCL vs HC）和 Chao 1 指数（P=0.02525 Active-NKTCL vs CRS;P=0.00308,Active-NKTCL vs HC）显著降低。根据PINK-E评分,高危组患者的 ACE 指数（P=0.00545,low risk vs high risk）和 Chao1 指数（P=0.03172,low riskvshighrisk）相较低危组显著升高;此外,与早期组患者相比,晚期组患者的ACE指数（P=0.01697）和Chao1指数（P=0.0331）亦显著升高。NKTCL相关的微生物基因功能预测 与HC组相比,NKT组有3种预测的微生物功能显著增加,包括:epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection,RNA transport 和 dioxin degradation,然而,16 个功能显著减少,包括:proteasome,styrene degradation 和 meiosis-yeast 等。此外,与 CRS 组相比,NKT组有 5 个功能显著增加,包括:epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection,pantothenate and CoA biosynthesis 和 lysine biosynthesis 等,19个功能显著减少,包括:glutathione metabolism,styrene degradation和geraniol degradation等,但经过FDR矫正后,CRS与NKT两组间微生物基因功能的差异未取得显著性。结论（1）NKTCL患者具有独特的鼻腔微生态特点。（2）鼻腔菌群在辅助NKTCL患者的早期诊断、疾病状态监测和危险分层中具有一定的意义。（3）鼻腔菌群及其功能改变可能与NKTCL的发生发展相关。