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研究背景:急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）幸存者中会有部分患者发生肾脏纤维化,并逐渐进展至慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）和终末期肾病,这给国家医疗和个人家庭带来沉重的经济负担。损伤后修复不良的肾小管上皮细胞是肾脏纤维化的主要因素。肾小管上皮细胞重吸收功能的正常发挥需要大量的能量供应,因此含有丰富的线粒体,并且主要依赖于脂肪酸氧化（Fatty acid oxidation,FAO）获取能量。FAO受损是肾脏纤维化的关键机制,越来越多的研究表明恢复受损的FAO可以减轻肾脏纤维化。线粒体稳态是FAO正常进行的基础,多种机制共同作用可调控和维持线粒体稳态,包括线粒体生物发生、线粒体自噬、线粒体裂变与融合、线粒体蛋白质质量控制等。间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）对CKD有较好的疗效。越来越多的证据表明,MSC的治疗作用主要归因于其旁分泌作用,尤其是细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）的释放。MSC的培养条件和生理状态对EVs的疗效至关重要,其中,低氧预处理MSC是增强其EVs疗效的有前景的策略之一,已在多种疾病中得到验证,但其在CKD的作用和机制尚不清楚。目的:1.探究低氧预处理MSC是否可以增强其分泌的EVs抗肾脏纤维化的作用。2.探究低氧预处理MSC来源的EVs是否可以通过调节线粒体稳态,恢复受损的FAO进而减轻肾脏纤维化。方法:第一部分1.采用左侧肾蒂夹闭30min,对侧肾脏摘除的方法建立肾缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,IRI）诱导的小鼠AKI-CKD模型。2.收集在常氧（21%O2）或低氧（1%O2）条件下培养的人胎盘来源MSC的细胞上清,然后利用差速超速离心法提取EVs。在本研究中“Norm-EVs”指常氧条件下培养的MSC来源的EVs,“Hypo-EVs”指低氧条件下培养的MSC来源的EVs。3.分别应用透射电子显微镜、动态光散射和Western Blot鉴定Norm-EVs和Hypo-EVs。应用小动物活体成像仪对小鼠体内Dil荧光探针标记的等量的Norm-EVs和Hypo-EVs进行示踪。4.实验小鼠分为4组,分别是Con、PBS、Norm-EVs和Hypo-EVs组。在IRI术后第2天、7天和14天处死小鼠留取肾脏组织,通过HE、PAS及Masson染色评估肾脏组织病理学改变;通过检测血清尿素氮水平确定其肾功能改变;应用Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测肾脏组织纤维化指标的改变。第二部分1.评估FAO的变化:用Western Blot和免疫组化检测FAO的关键限速酶CPT1A的表达,RT-q PCR检测FAO其他代谢酶ACOX2和CPT2的表达。2.评估线粒体稳态的变化:应用透射电子显微镜观察肾脏组织中线粒体形态改变,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的变化,Mito SOX Red试剂盒检测活性氧（ROS）的水平,ATP检测试剂盒评估肾脏组织ATP的水平。3.评估线粒体稳态调节机制的变化:用Western Blot、免疫组化或RT-qPCR检测线粒体生物发生（PGC1-α、TFAM和TOM20）、线粒体自噬（Pink1、Parkin、P62和LC3）、线粒体裂变和融合（Drp1和Opa1）、线粒体质量蛋白（ATPB、COX IV和SDHB）的表达水平。结果:第一部分1.EVs的提取及鉴定:Norm-EVs和Hypo-EVs均为典型的圆形或者椭圆形双层膜结构,粒径分布均在25nm至280nm之间,Western Blot均可检测到EVs的阳性标志蛋白,以上结果均提示Norm-EVs和Hypo-EVs的成功提取。2.EVs的体内示踪:在Norm-EVs和Hypo-EVs治疗组中左侧肾脏区域均可检测到Dil标记的荧光信号,提示Norm-EVs和Hypo-EVs均可到达肾脏损伤部位。3.EVs对肾脏组织形态学的作用:肾脏组织病理染色结果显示,在IRI术后2天、7天和14天,纤维化表型随着疾病进展逐渐加重。对损伤后第14天的Masson染色结果进行统计分析,结果显示,与对照组相比,PBS组可见明显的胶原沉积和肾小管萎缩,Norm-EVs和Hypo-EVs治疗后上述病变明显减轻,其中Hypo-EVs治疗后胶原沉积减轻更显著（P＜0.05）。4.EVs对肾功能的作用:在IRI损伤后第14天,与对照组相比,PBS组血清尿素氮水平明显升高,Hypo-EVs治疗后尿素氮水平降低（P＜0.05）。5.EVs对纤维化指标的作用:免疫荧光结果显示,与对照组相比,PBS组中α-SMA和Collagen I表达显著增加,Norm-EVs和Hypo-EVs治疗后表达均下降,且Hypo-EVs的抑制作用更显著（P＜0.05）。Western Blot的结果显示,与对照组相比,PBS组Vimentin的表达水平明显增加,Hypo-EVs治疗后表达显著下调（P＜0.05）。第二部分1.EVs对FAO的影响:与对照组相比,PBS组中FAO的关键限速酶CPT1A表达明显减少,Hypo-EVs治疗后,CPT1A的表达显著上调（P＜0.05）。2.EVs对线粒体稳态的影响:电镜结果显示,与对照组相比,PBS组线粒体数量明显减少,典型的短棒状结构丢失,线粒体嵴断裂,线粒体肿胀变形,线粒体膜电位受损,ROS水平增加,ATP的生成减少,Hypo-EVs治疗后上述线粒体形态学上的破坏和线粒体膜电位明显恢复,ROS水平减少,ATP的生成显著上调。3.EVs对线粒体稳态调节机制的影响:Western Blot的结果显示,与对照组相比,PBS组线粒体生物发生指标PGC1-α、TFAM和TOM20表达均下调,Norm-EVs治疗后上述分子表达均上调,Hypo-EVs治疗后TFAM表达上调（P＜0.05）。与对照组相比,PBS组线粒体自噬指标Pink1和Parkin表达下调,LC3 II/LC3 I的比值和P62的表达上调,Norm-EVs和Hypo-EVs治疗后Pink1和Parkin表达均上调,LC3 II/LC3 I的比值和P62的表达被抑制。与对照组相比,PBS组线粒体融合蛋白Opa1表达下调,线粒体裂变蛋白Drp1表达上调,Norm-EVs和Hypo-EVs治疗后Opa1表达上调,Drp1表达被抑制,其中Hypo-EVs对Drp1的抑制作用比Norm-EVs更显著（P＜0.05）。与对照组相比,PBS组中线粒体质量蛋白ATPB、COX IV和SDHB的表达明显减少,Hypo-EVs治疗后ATPB和SDHB蛋白表达水平显著上调（P＜0.05）;结论:1.低氧预处理可以增强MSC分泌的EVs抗肾脏纤维化的作用;2.Hypo-EVs主要通过恢复CPT1A介导的线粒体FAO产生肾脏保护作用,这种效应的产生可能部分归因于其对线粒体稳态的调节,尤其是对线粒体蛋白质质量控制和线粒体裂变的调节作用。