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研究背景心血管系统疾病是全球范围内导致患者死亡的主要原因,其中缺血性心脏病是其中的重要组成部分。氧化应激是缺血性心脏病发生发展过程中的一种负面作用,可以导致心肌细胞发生不可逆的损伤甚至死亡。氧化应激通过多种途径激活心肌细胞自噬,适度的自噬可以维持心肌细胞功能,但过度的细胞自噬会诱导心肌细胞发生死亡。ATG12蛋白是自噬过程中类泛素偶联系统的重要组成部分,它直接参与了自噬体膜的形成过程。深入探究氧化应激中细胞自噬的作用,并基于ATG12的变化寻找其可能的调控分子,将为心肌细胞氧化应激损伤的研究提供明确方向。外泌体是细胞间信息交流的重要媒介,它可以通过携带多种信号传导分子调节心肌细胞生理功能或病理状态,发挥保护作用。缺氧能够诱导外泌体的分泌并增强其靶向作用能力,同时影响其内信号分子的表达。Micro RNA(mi RNA)是外泌体中含量丰富的一类RNA,具有靶向调控基因表达的能力。Micro RNA-21(mi R-21)是典型的缺氧响应性mi RNA,能够通过多种途径影响细胞生存,并在缺氧诱导的外泌体中明显富集。因此,深入研究其在氧化应激损伤中的作用并明确其对细胞自噬的调控机制,将为外泌体的临床应用提供可能。研究目的1、探究过氧化氢模拟的氧化应激对心肌细胞损伤的影响,明确缺氧诱导的外泌体对心肌细胞氧化应激损伤的作用。2、探究氧化应激对细胞自噬的影响,明确细胞自噬在氧化应激损伤中的作用,并进一步探讨缺氧诱导的外泌体对氧化应激介导的细胞自噬的影响。3、阐明缺氧诱导的外泌体对氧化应激损伤的影响是否通过mi R-21/ATG12实现。研究方法1、应用过氧化氢构建心肌细胞氧化应激损伤模型,CCK-8试剂盒检测细胞活性、Ed U试剂盒检测细胞增殖、LDH试剂盒检测细胞损伤、ROS试剂盒检测细胞活性氧水平,评价氧化应激对心肌细胞的影响。2、应用厌氧产气袋构建细胞缺氧模型,超速离心法提取缺氧诱导的外泌体,应用透射电镜观察外泌体结构、动态光散射分析粒子直径、Western blot法检测CD9、TSG101和HSP70等外泌体标志蛋白和阴性对照蛋白Calnexin的水平。检测HIF-1α、RAB27a、SYTL4等蛋白的水平,明确缺氧对心肌细胞外泌体分泌的影响。利用PKH67标记外泌体,与心肌细胞共培养后,共聚焦显微镜观察外泌体摄取情况,检测共培养后细胞活性、增殖和LDH的变化,探究缺氧诱导的外泌体对心肌细胞氧化应激损伤的影响。3、过氧化氢刺激大鼠心肌H9c2细胞,透射电镜观察细胞内自噬小体的变化,转染m Cherry-GFP-LC3重组腺病毒后检测细胞自噬流变化,Western blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、P62、ATG12和ATG5的水平。加入自噬抑制剂3-MA,检测细胞活性、增殖和LDH的变化,免疫荧光染色观察LC3的点状聚集情况,Western blot检测Beclin-1、LC3和P62等蛋白的水平。加入缺氧诱导的外泌体,重复上述实验,并检测ATG12的水平,探究缺氧诱导的外泌体对氧化应激介导的细胞自噬的影响。4、通过生物信息学预测ATG12基因与mi R-21的结合位点,利用双荧光素酶报告基因实验验证ATG12基因与mi R-21的靶向性关系。转染mi R-21 mimics和mi R-21 inhibitor构建mi R-21高、低表达模型,检测细胞活性、LDH、LC3和P62以及ATG12的水平。构建ATG12高表达细胞模型,检测细胞活性变化和LC3与P62的水平。实时定量PCR检测过氧化氢刺激后心肌细胞内mi R-21的水平、在常氧和缺氧培养条件下心肌细胞和外泌体中mi R-21的水平,以及缺氧诱导的外泌体与心肌细胞共培养后mi R-21的水平。在低表达mi R-21心肌细胞中提取缺氧诱导的外泌体,实时定量PCR检测mi R-21的表达水平。抑制外泌体mi R-21后检测细胞活性变化、LDH、LC3和P62的水平。研究结果1、过氧化氢刺激引起大鼠心肌H9c2细胞活性和增殖呈时间和浓度依赖性的降低,LDH活性和活性氧水平呈时间依赖性的升高。2、在缺氧诱导下,HIF-1α/RAB27a/SYTL4通路激活,H9c2细胞分泌外泌体显著增多。缺氧诱导的外泌体能够被H9c2细胞摄取,加入缺氧诱导的外泌体后,H9c2细胞活性和增殖明显升高,LDH活性明显下降。3、过氧化氢刺激H9c2细胞内自噬小体增加,自噬流增加,Beclin-1与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平显著升高,P62的水平显著下降;加入3-MA后细胞活性和增殖明显升高,LDH活性明显下降,免疫荧光染色中LC3的点状聚集明显减少,Beclin-1与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平明显下降,P62的水平明显升高,ATG12和ATG5的表达明显增加;加入缺氧诱导的外泌体后,自噬小体减少,自噬流减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平明显下降,P62的水平明显升高,ATG12的表达明显减少。4、MiR-21序列与ATG12基因具有靶向性关系。过氧化氢刺激H9c2细胞内mi R-21表达水平下降;高表达mi R-21增加了过氧化氢刺激后的细胞活性、降低LDH水平,降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平,提高P62的水平,抑制了自噬的发生,抑制了ATG12的表达;低表达mi R-21的结果与前述相反;高表达ATG12可以拮抗高表达mi R-21对细胞自噬的调控作用。在缺氧诱导下,H9c2细胞及其外泌体中mi R-21的表达显著升高,缺氧诱导的外泌体mi R-21能够进入H9c2细胞内,在过氧化氢刺激下,抑制缺氧诱导的外泌体mi R-21的表达后,细胞活性降低、LDH水平升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平升高,P62的水平下降。结论过氧化氢能够诱导H9c2细胞氧化应激损伤,并激活细胞自噬。缺氧能诱导心肌细胞外泌体分泌,外泌体通过mi R-21/ATG12抑制细胞自噬,减轻氧化应激介导的细胞损伤。创新点及研究意义本研究解决了细胞自噬在氧化应激损伤中的作用,并发现了中间分子ATG12在氧化应激介导的细胞自噬中的作用,为治疗靶点的选择提供了新的方向。研究也明确了缺氧诱导的心肌细胞外泌体能够减轻氧化应激造成的细胞损伤,为抗氧化应激损伤的治疗提供了新的思路。同时研究发现了外泌体mi R-21能够作为ATG12的上游调控分子,通过抑制ATG12的表达抑制细胞自噬,发挥保护作用,为外泌体应用于临床治疗提供了理论基础。