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猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease,PCVAD）的主要病原,给养猪业造成巨大的经济损失。现阶段我国使用较广的全病毒灭活疫苗存在培养获得的病毒滴度低、灭活不彻底存在安全隐患等缺陷。因此,研究更安全、高效、低廉的新型基因工程疫苗对于预防和控制PCVAD具有重要意义。PCV2 ORF2基因编码的核衣壳蛋白Cap是研制PCV2亚单位疫苗的理想抗原。已有研究表明,保护性抗原基因与多表位基因融合具有协同作用,能更好的诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答。CD154（CD40L）由活化的CD4+T细胞、活化的B细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等表达,有研究证明CD154等分子佐剂可显著提高疫苗的免疫保护效力。因此,本研究分别采用PCV2优势T、B细胞抗原表位融合Cap蛋白与PCV2-Cap+CD154蛋白两种不同策略研制PCV2新型基因工程亚单位疫苗,并对其进行免疫效力评价。本研究将优势T、B细胞线性抗原表位基因串联在PCV2 Cap基因序列上,于N端和C端分别引入蜂毒信号肽（Melittin）和6个组氨酸,并针对昆虫细胞的密码子优化,人工合成获得PCV2-TBCap基因。将PCV2-Cap、PCV2-TBCap和猪源CD154分别克隆至p Fast Bac Dual载体,经PCR鉴定、双酶切鉴定及基因序列测定后,获得单表达重组转移质粒p FBD-Cap、p FBD-TBCap、p FBD-CD154和共表达重组转移质粒p FBD-CD154-Cap、p FBD-CD154-TBCap。将5个重组转移质粒分别转化DH10Bac感受态细胞,经蓝白班筛选和PCR鉴定后,获得重组杆状病毒质粒r Bac-Cap、r Bac-TBCap、r Bac-CD154、r Bac-CD154-Cap和r Bac-CD154-TBCap。将上述重组杆状病毒质粒分别转染sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac-Cap、Ac-TBCap、Ac-CD154、Ac-CD154-Cap和Ac-CD154-TBCap。将P3代重组杆状病毒Ac-Cap、Ac-TBCap、Ac-CD154、Ac-CD154-Cap和Ac-CD154-TBCap分别感染High-five细胞,通过Western blot检测细胞中重组蛋白的表达情况,使用Image J对目的蛋白进行半定量分析。结果显示,分别以猪抗PCV2阳性血清和His标签单克隆抗体为一抗,感染Ac-Cap的细胞样品均在28 k Da左右检测到与PCV2-Cap分子量相同的特异性条带,表达量为300～349μg/m L;感染Ac-TBCap的细胞样品均在44 k Da左右检测到与重组PCV2-TBCap蛋白分子量相同的特异性条带,表达量为287～330μg/m L。分别以CD154单克隆抗体和His标签单克隆抗体为一抗,感染Ac-CD154的细胞样品均在30 k Da左右检测到与重组CD154蛋白分子量相符的清晰条带,表达量约为203μg/m L。以His标签单克隆抗体为一抗,感染Ac-CD154-Cap的细胞样品在28 k Da和30 k Da左右分别检测到与PCV2-Cap和猪源CD154蛋白大小相同的特异性条带;感染Ac-CD154-TBCap的细胞样品在44 k Da和30 k Da左右分别检测到与PCV2-TBCap和猪源CD154蛋白大小相吻合的特异性条带。表明本研究表达的重组蛋白均具有良好的抗原性。分别将获得的PCV2-Cap和PCV2-TBCap蛋白与Montanide TM GEL 01佐剂按体积比4:1混合制备成PCV2亚单位疫苗,将疫苗经质量检测后以200μg/头免疫1月龄仔猪以评价其免疫原性。分组如下:组1:Cap组;组2:TBCap组;组3:PBS组;组4:空白对照组。于首次免疫后第14 d以相同剂量加强免疫。用间接ELISA试剂盒检测首免后第7、14、21、28 d的血清抗体水平。除PBS组,所有仔猪在首次免疫后第28 d用3 m L PCV2-LG株(105.5TCID50/m L)攻毒。结果显示,PCV2-Cap和PCV2-TBCap蛋白均能刺激仔猪产生针对PCV2的特异性抗体,加强免疫2周后重组TBCap组的抗体水平显著高于Cap组。攻毒后,重组TBCap组和Cap组未见明显的临床症状,而未免疫攻毒组仔猪出现食欲不振、被毛粗乱、行动迟缓和精神沉郁的典型临床症状。重组TBCap组和Cap组在攻毒后第14 d和第28 d病毒血症均为阴性,淋巴结中PCV2载量降低,其中TBCap组PCV2载量明显低于Cap组;重组TBCap组和Cap组的肺脏、淋巴结、肾脏等组织病理变化不明显,两免疫组在很大程度上减轻了PCV2在淋巴结中的增殖,从而对免疫仔猪提供免疫保护。分别将获得的重组蛋白与ISA 201VG佐剂按体积比1:1乳化制备成PCV2亚单位疫苗,将疫苗经质量检测后免疫4周龄BALB/c小鼠以评价其免疫原性。分组如下:组1:Cap组;组2:TBCap组;组3:CD154+Cap组;组4:CD154+TBCap组;组5:商品化PCV2亚单位疫苗组6:PBS组。于首次免疫后第14 d、28 d以相同剂量加强免疫。用ELISA试剂盒检测首次免疫后第0、14、28、42 d小鼠血清中抗体水平,于首次免疫后第42 d进行淋巴细胞增殖试验及细胞因子检测。除PBS组,其余各组小鼠在首次免疫后第42 d用350μL PCV2-LG株(105.5TCID50/m L)攻毒。结果显示,三免后引入了多抗原表位的TBCap组以及CD154+Cap组、CD154+TBCap组较Cap组均能诱导小鼠产生更高水平的体液免疫应答、淋巴细胞增殖反应以及偏向Th1型的免疫应答。攻毒后,CD154+Cap组和TBCap组较Cap组更能够有效降低PCV2病毒血症强度,CD154+Cap组和CD154+TBCap组均能在很大程度上降低小鼠脾脏和肺脏中的PCV2载量,从而为小鼠提供更高的保护力。综上,本研究制备的PCV2优势T、B细胞抗原表位融合Cap蛋白（TBCap蛋白）在引入多抗原表位后免疫原性显著高于Cap蛋白,有望成为PCV2亚单位疫苗研发的优良候选蛋白;CD154分子佐剂能够增强PCV2-Cap蛋白的免疫效力,该分子佐剂的引入为PCV2新型亚单位疫苗的研制提供了一种新策略和新途径。