急性白血病是在骨髓和其他造血组织中原始和幼稚细胞异常增生的恶性疾病，平均自然病程半年，在30岁以下人群的肿瘤发病率中占据首要地位。其中急性单核细胞白血病的高白细胞性白血病发生率高，髓外浸润严重，治疗难度大，预后较差。虽然联合化疗和造血干细胞移植的开展，大大提高了缓解率，但仍存在缓解后复发、移植供者少等问题。近年来生物制剂逐渐引起人们的重视并已应用于肿瘤的临床治疗。白细胞介素—27(interleukine27，IL—27)是2002年发现并命名的一种新的细胞因子，它与IL-12以及另一种新发现的细胞因子IL—23共同组成IL-12分子家族，具有复杂的生物学功能，在抗感染免疫，抗肿瘤免疫以及自身免疫病中发挥着重要的作用。IL—27主要通过肿瘤特异性CD8+T细胞、分泌IL-12发挥抗肿瘤作用，而对免疫原性低的肿瘤，则可以通过抑制血管形成来抑制肿瘤的生长和转移。此外，IL—27尚能不依赖免疫细胞而发挥抗瘤效应。IL—27的抗肿瘤作用研究目前多局限于黑色素瘤，结肠癌，神经胶质瘤、神经母细胞瘤、食管癌、原发性肝癌等实体瘤，与造血系统恶性肿瘤的关系尚不明确，在诱导靶细胞凋亡方面的研究也鲜见报道。 为了探讨IL—27在白血病中的性质和作用，我们完成了以下研究工作：检测了31例AML病人和8例非恶性血液病患者BM—MNCs的IL—27受体(WSX-1和gp130)mRNA基因表达情况，探讨IL—27在急性髓细胞白血病发病中的意义。我们的研究发现，IL—27受体WSX-1和gp130在AML患者中表达明显高于非恶性血液病患者(包括IDA、ITP和非血液病患者)，尤其在AML—Ms(急性单核细胞白血病)病人高表达，在此基础上，我们利用人急性单核细胞白血病细胞株U937为研究对象，探讨rhIL—27诱导U937细胞分泌抗肿瘤性细胞因子，抑制细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡作用，发现rhIL—27能够诱导U937细胞产生抗肿瘤性细胞因子TNF—α和IL-12，抑制U937细胞生长并诱导细胞凋亡，且细胞增殖抑制率、细胞凋亡率与TNF—α分泌量呈正线性相关。我们的工作首次证明，与实体瘤相似，IL—27亦可抑制造血系统恶性肿瘤，具体作用机制值得进一步探讨。 研究目的： 一、检测人白介素27的两个受体(WSX-1和gp130)在急性髓细胞白血病病人与非恶性血液病病人的骨髓单个核细胞(BM—MNCs)上的表达差异； 二、研究IL—27诱导人单核白血病细胞U937分泌抗肿瘤细胞因子TNF—α和IL-12，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。 材料和方法： 一、实验材料 (一)主要仪器设备 CO2培养箱，超净工作台，PCR仪，酶标仪，核酸蛋白分析仪，台式超速离心机，恒压电泳仪，凝胶成像分析系统，荧光正置显微镜，流式细胞仪。 (二)试剂及细胞株 U937细胞株；6孔、24孔、96孔细胞培养板，细胞培养瓶；小牛血清，RPMI1640培养基；淋巴细胞分离液、琼脂糖，TRIzol；100bp DNA ladder marker、cDNA第一链合成试剂盒、2×Taq PCR MasterMi试剂盒；阿糖胞苷(Ara—C)；四氮甲唑蓝(MTT)、DMSO；人IL-12 ELISA试剂盒、人TNF—α ELISA试剂盒。FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit，人重组IL—27，Hoechst染色试剂盒。 二、实验方法 收集我科31例初治及复发成人AML患者骨髓血，同时采集8例非恶性血液病患者骨髓(包括IDA、ITP，非血液病患者)为对照，所有白血病患者骨髓幼稚细胞比例均>60％，经过临床、骨髓细胞形态学、组织化学染色以及流式细胞术进行细胞表面标志物检查，按照2001年WHO诊断标准确诊。31例患者包括急性粒细胞白血病未分化型(M1)1例，急性粒细胞白血病部分分化型(M2)10例，急性早幼粒细胞白血病(M3)7例，急性粒单核细胞白血病(M4)3例，急性单核细胞白血病(M5)10例。从入骨髓血单个核细胞中提取总RNA，经逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)检测目的基因WSX-1和gp130的表达条带。此基础上，在体外以人急性单核细胞白血病细胞株U937为研究对象，以不同浓度rhIL—27刺激细胞，采用ELISA法测定培养上清中IL-12和TNF—α水平，MTT比色法测定细胞生长抑制率，Hoechst染色鉴定凋亡细胞的形态学特征，AnnexinV/PI双染流式检测凋亡细胞的百分率。 三、统计学分析 实验至少重复三次。所有数据均以均数±标准差(±s，n=3)表示，使用SPSS13.0统计软件对资料进行独立样本单向方差分析及两变量线性相关分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。 实验结果： 一、IL—27受体表达情况 AML患者IL—27受体亚基WSX-1表达率明显高于对照组(67.5％vs37.5％，P<0.05)，gp130亚基表达率明显高于对照组(58.1％vs25％，P<0.05)，两者共表达率也明显高于对照组(42.0％vs12.5％，P<0.05)。在AML各亚型中，以M5(急性单核细胞白血病)表达率最高，两个亚基共表达率达90％，与对照组有显著性差异(90％vs12.5％，P<0.01)。 二、细胞因子的检测结果 rhIL—27诱导U937细胞分泌IL-12和TNF—α两种抗肿瘤细胞因子，且TNF—α分泌量远高于IL-12。细胞因子分泌量与rhIL—27处理时间和浓度有关，其浓度为80ng/ml、作用于24小时后的分泌量达到最大值。实验组与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。 三、MTT法检测细胞增殖效率 MTT实验结果表明，rhIL—27能显著抑制U937细胞的增殖，且呈时间、剂量依赖性关系，10ng/ml的rhIL—27对U937增殖抑制作用较小，20ng/ml以上浓度的rhIL—27对U937细胞增殖有明显抑制作用，且随作用浓度的提高、作用时间的延长，其抑制率也相应增加。对细胞增殖抑制率与TNF—α、IL-12分泌量进行线性相关分析，发现细胞增殖抑制率与TNF—α分泌量呈正线性相关(r=0.869，P<0.05)。 四、不同浓度rhIL—27诱导U937凋亡的情况 处理48小时，阴性对照组细胞凋亡率为(3.10±0.23)％，阳性对照组5ug/mlAra—c处理组的细胞凋亡率为(49.52±0.82)％；IL—27处理组(作用浓度为10、20、40、60、80、100ng/ml)细胞凋亡率分别为(6.08±0.45)％，(11.63±0.30)％，(12.91±0.11)％，(21.23±0.18)％、(31.94±0.45)％，(47.20±0.96)％。表明U937细胞随着IL—27浓度增加凋亡率不断增加，在100ng/ml达到峰值。细胞增殖抑制率与TNF—α分泌量呈线性相关(r=0.812，P<0.05)。 五、Hoechst凋亡染色结果 以Hoechst33258染色后在荧光正置显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈淡蓝色，而凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，并可见典型的凋亡小体。 结论： 1.IL—27受体WSX-1和gp130在急性髓细胞白血病患者中组成性表达明显高于非恶性血液病患者(包括IDA、ITP和非血液病患者)，尤其在AML—M5亚型(急性单核细胞白血病)病人高表达，提示IL—27受体组成性高表达可能在急性单核细胞白血病更有意义。 2.MTT实验证实rhIL—27对U937细胞有增殖抑制作用。20ng/ml以上浓度的rhIL—27对U937细胞增殖有明显抑制作用，且随着作用浓度的提高、作用时间的延长，其抑制率也相应增加。 3.凋亡细胞形态学鉴定、流式细胞仪检测均有力证明rhIL—27能以浓度、时间依赖性方式诱导U937细胞凋亡，细胞凋亡率在作用浓度为100ng/ml，48h达到顶峰。 4.rhIL—27能刺激U937细胞分泌较高水平的TNF—α和IL-12等Th1类细胞因子的产生，其分泌量具有剂量依赖性和时间依赖性关系，其中TNF—α分泌水平远高于IL-12。细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均与TNF—α分泌量呈线性相关，提示IL—27对U937的增殖抑制和诱导作用可能刺激细胞分泌TNF—α有关。