论文部分内容阅读
造血干/祖细胞（Hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC）移植在治疗恶性血液疾病和免疫系统疾病方面有着广泛的应用。脐带血由于其中HSPC含量高、扩增能力强、免疫原性低、采集方便以及对供体无害等优势而成为理想HSPC来源。由于单份脐带血中HSPC的绝对数量有限,难以满足成年人治疗所需的剂量,限制了其临床应用。高效的HSPC体外扩增技术是突破这一难题的关键。目前的体外扩增技术多采用干细胞因子（Stem cell factor,SCF）、血小板生成素（Thrombopoietin,TPO）、Flt-3 配体（FMS-like tyrosine kinase-3 Ligand,FL）的细胞因子组合,这些细胞因子通过结合HSPC表面相关受体,激活胞内对应的信号通路使HSPC进入细胞周期进行扩增。SCF和FL均可激活PI3K信号通路和MEK/ERK信号通路,并可进一步通过PI3K蛋白而抑制Wnt信号通路的负控蛋白糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase-3,GSK-3）从而激活Wnt信号通路。此外,TPO还能够介导MEK/ERK和NF-κB通路的激活。然而现有的体外扩增技术不可避免会导致HSPC分化使其功能受损,无法实现HSPC大量扩增和功能维持。因此,这些信号通路在HSPC体外扩增及功能维持中的作用以及如何在体外扩增过程中调控相关信号通路,平衡HSPC扩增和功能维持的关系是一个值得研究的问题。为此,本文以Wnt、MEK/ERK、NF-κB三条信号通路为研究对象,以脐带血CD34+细胞为起始细胞,采用含有SCF/TPO/FLT-3细胞因子组合的无血清培养体系,通过在培养过程中添加信号通路的调节剂,研究相关信号通路的激活状态对HSPC扩增和功能维持的影响并探讨其作用机制,为实现HSPC体外高效扩增提供理论和技术支持。本文首先采用Wnt通路小分子激活剂6-溴靛红-3’-肟（6-Bromoindirubin-3’-oxime,BIO）研究了Wnt通路的激活状态对HSPC体外扩增的影响。选用了0、5、25、50、100 nM五种添加浓度,以CD34+细胞的扩增倍数为指标,确定其最适添加浓度为100 nM。在扩增过程中添加100 nM BIO组的总细胞及CD34+细胞扩增倍数在第4天时显著高于不添加的对照组,而在第7天时显著低于对照组相,但扩增7天的CD34+细胞集落形成能力以及二次扩增能力均高于对照组。培养7天时添加BIO组扩增的CD34+细胞中Wnt通路相关基因CTNNB、AXIN2、APC和GSK3与对照组细胞呈差异表达,胞内β-catenin含量明显升高,提示此时细胞内Wnt通路处于过度激活状态,不利于CD34+细胞的扩增但有利于其功能维持。据此对体外扩增过程中的BIO添加策略进行了优化,采用仅在0和7天添加BIO的策略培养CD34+细胞,结果扩增10天时CD34+细胞、CD34+CD38-细胞扩增倍数和CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+细胞扩增分别可达到28.7±0.4倍、23.8±0.8倍和4.5±1.0倍,均显著高于无添加对照组的16.2±0.7倍、13.4±0.8倍和2.2 ± 0.2倍和0、4、7天均添加BIO组的11.8 ± 1.7倍、10.6±1.6倍和1.9±0.4倍;扩增后CD34+细胞的集落形成能力和二次扩增能力均与其它两组相近。此时,CD34+细胞内β-catenin含量在三组中处于中等水平,Wnt信号通路下游与细胞扩增相关靶基因的表达上调,细胞凋亡显著降低,表明适度激活的Wnt信号通路可促进HSPC体外扩增。其次,本文以MEK/ERK信号通路的MEK1蛋白为靶点,采用小分子化合物以及基因沉默的手段调节其表达和活性,研究MEK/ERK信号通路在HSPC体外扩增中的作用及机制。采用Trametinib抑制CD34+细胞内MEK1活性及通过MEK1-siRNA转染沉默CD34+细胞内MEK1表达后,CD34+细胞的体外扩增能力均显著下降,推测激活MEK/ERK信号通路是HSPC体外扩增所必须。进而选用MEK1特异性小分子激活剂PAF C-16,分别在第 0、4 和 7 天时添加 100、500、1000、5000 nM PAF C-16 培养CD34+细胞,发现添加500 nM浓度的PAF C-16培养10天后CD34+细胞、CD34+CD38-细胞和CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+细胞数量分别比对照组显著增加了 2.22倍、2.53倍和2.04倍,但添加500 nM PAF C-16扩增后表型HSPC比例和二次扩增能力无显著变化。分析扩增后CD34+细胞集落形成潜能发现,添加500 nM PAF C-16组红系集落数量显著增加,且培养物中CD71+CD235a-原始红系祖细胞比例也显著增加;同时CD34+细胞中c-Myc基因表达水平和蛋白含量升高,进入细胞周期的CD34+细胞比例和细胞增殖速率增加,表明激活MEK/ERK信号通路可通过上调c-Myc表达促进HSPC体外增殖。最后,采用NF-κB通路小分子抑制剂TPCA-1研究了 NF-κB信号通路对HSPC体外扩增、功能维持以及细胞代谢的影响。在本文所采用的培养体系中在0、4和7天时添加50、100、300、500和1000 nM的TPCA-1培养CD34+细胞,根据其扩增效果确定最适添加浓度为100 nM。添加100 nM TPCA-1组培养10天时的CD34+CD38-细胞和CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+细胞的扩增倍数分别为 29.5±3.8 倍和 5.4±0.9倍,均显著高于无添加对照组的18.2±1.0倍和2.9±0.6倍,且该策略下CD34+CD38-细胞、CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f细胞和CD34+EPCR+细胞的比例均显著高于无添加的对照组;扩增后CD34+细胞中与功能维持相关基因PU.1、Hoxa9、MEIS1、HOXB4的表达显著上调,其连续集落形成能力和二次扩增能力也显著高于对照组。分析扩增后CD34+细胞的能量代谢特性,发现添加TPCA-1组CD34+细胞中编码线粒体生物发生调节子的Pgc1α基因和编码线粒体伴侣蛋白酶的ClpP、Hsp10、Hsp60基因的表达显著下调,线粒体质量、膜电位和线粒体活性氧（ROS）水平显著降低,氧化磷酸化代谢减弱而糖酵解水平提高增加。结果表明抑制NF-κB信号通路可改变HSPC的代谢状态,使其更多地利用糖酵解产生能量,限制胞内线粒体活性和ROS水平,从而促进HSPC的体外扩增和功能维持。本文研究了 HSPC体外扩增过程中与细胞因子相关的信号通路的激活状态对HSPC扩增、功能维持以及细胞代谢的影响及作用机制,建立了基于信号通路调控的HSPC体外扩增策略。研究结果为阐释体外扩增过程中HSPC胞内的Wnt、MEK/ERK、NF-κB信号通路调控HSPC生物学特性的机制奠定了良好基础,为建立规模化、标准化的HSPC体外扩增技术提供了依据,对推动HSPC的临床应用具有重要理论和实际意义。