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目的本课题将从动物模型和体外细胞实验两个方面研究细胞外亲环蛋白A在心肌细胞肥大中的作用及其潜在机制。方法饲养SD大鼠,采用皮下多点注射异丙肾上腺素构建病理性心肌肥厚模型,通过荧光定量PCR检测心肌肥大标志基因,HE染色、Masson染色分别评估心肌细胞肥大和纤维化。使用二氢乙锭(Dihydroethidium,DHE)染色观察心肌组织中活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的产生。通过ELISA检测分泌到血清中的亲环蛋白A(Cyclophilin A,CyPA)表达量。通过Western blot检测心肌组织中CyPA、β-actin的蛋白表达水平。应用免疫组织化学进一步明确CyPA在心肌组织中的表达和定位。体外培养H9c2大鼠心肌细胞,外源性给予重组CyPA刺激。通过荧光定量PCR检测心肌肥大标志基因,鬼笔环肽染色后测量细胞表面积。使用DHE染色和电子自旋共振波谱仪(Electron Spin Resonance,ESR)观察H9c2细胞中ROS产生。应用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶抑制剂后观察氧化应激水平。通过Western blot检测p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、ERK1/2、p38、JNK、p47phox、Nox1、Nox2、Nox4、EMMPRIN、β-actin、Na~+/K~+ATPase的蛋白表达量。应用共聚焦显微镜观察p47phox在H9c2细胞膜的定位。使用ERK、p38、JNK抑制剂分别抑制ERK、p38、JNK磷酸化后,检测心肌肥大指标。最后,通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)小干扰RNA沉默EMMPRIN表达,检测细胞外CyPA介导的心肌细胞肥大,ROS水平以及MAPK、p47phox信号通路的激活。结果(1)注射异丙肾上腺素组大鼠心肌组织中心肌肥大标志基因、心肌细胞表面积、心肌间质纤维化明显上升(p<0.05),ROS水平显著增加(p<0.05);心肌肥厚大鼠血清中CyPA的分泌量上升,心肌组织中CyPA表达水平增加,并且定位于肥大心肌细胞周围的纤维化间质,而不是心肌细胞(p<0.05)。(2)外源性给予CyPA刺激H9c2细胞中心肌细胞肥大指标以及氧化应激指标上调(p<0.05);并且NAC(一种非特异性ROS抑制剂)和VAS2870(一种特异性NADPH氧化酶抑制剂)均明显阻断细胞外CyPA介导的ROS产生(p<0.05);CyPA刺激后的H9c2细胞总蛋白中p47phox(NADPH氧化酶的胞质亚基)表达没有明显变化(p>0.05),然而膜蛋白中p47phox表达在CyPA的作用下呈时间依赖性增加(p<0.05);VAS2870可以显著干预细胞外CyPA介导心肌细胞肥大(p<0.05)。(3)CyPA刺激组ERK1/2、p38、JNK均被激活(p<0.05);PD98059(ERK1/2抑制剂)的预处理可以显著阻断细胞外CyPA介导的心肌肥大指标(p<0.05),而BIRB 796(p38抑制剂)和SP600125(JNK抑制剂)无明显干预作用(p>0.05)。(4)在PD98059的干预作用下,细胞外CyPA介导的ROS产生,p47phox膜移位明显被抑制(p<0.05);同时Nox1,Nox2和Nox4(主要在心肌细胞中表达的NADPH氧化酶的膜结合亚基)的蛋白表达水平没有显著变化(p>0.05)。(5)外源性给予CyPA不能上调H9c2细胞中EMMPRIN的蛋白表达水平(p>0.05);但应用转染小干扰RNA沉默EMMPRIN表达后,细胞外CyPA介导的心肌细胞肥大,ROS产生,以及MAPK/p47phox的激活均被明显抑制(p<0.05)。结论(1)细胞外CyPA在异丙肾上腺素诱导的病理性心肌肥厚大鼠中表达上调。(2)细胞外CyPA通过激活NADPH氧化酶介导H9c2心肌细胞肥大。(3)ERK信号通路参与调控细胞外CyPA诱导的H9c2心肌细胞肥大(4)细胞外CyPA通过ERK/p47phox信号通路激活NADPH氧化酶。(5)EMMPRIN是细胞外CyPA介导心肌细胞肥大、氧化应激以及MAPK、p47phox信号通路激活所必需的。