论文部分内容阅读
DNA修复是细胞对受损伤的DNA进行纠正结构和功能的过程。机体DNA修复基因受到损伤是肿瘤发病的重要原因。错配修复(mismatch repair, MMR)和碱基切除修复(base excision repair, BER)是DNA修复的两大组成部分。本论文立足于MMR系统中的hMSH2基因以及BER系统中的hMUTYH基因的变异与肿瘤发病风险及分子机制研究。本研究分为两个部分进行:第一部分:hMSH2、hMSH6蛋白相互作用体系的初步探索及hMSH2错义突变的功能评估遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)是一种常染色体显性遗传性恶性肿瘤,其病因为家族中存在错配修复基因的胚系突变,而hMSH2是其中最常检出突变的基因之一。在已报道的hMSH2胚系突变中,约三分之一是错义突变。鉴于现有分析手段的限制,对于错义突变的病因学作用往往难以确定。本研究的研究对象为东亚人群疑似遗传性胃肠肿瘤患者中频繁检出的9个hMSH2错义突变:hMSH2c.505A>G、c.518T>G、c.1168OT、 c.1255C>A、 c.1261C>A、c.1886A>G、c.2108C>A、 c.2516A>G。阳性对照为病理性的移码突变hMSH2c.1664delA。本研究首先采用基因克隆技术从质粒pFastBac1-hMSH2、PFastBac1-hMSH6构建了酵母双杂交重组质粒pGADT7-hMSH2. pGBKT7-hMSH6。通过定点诱变技术构建了10个pGADT7-hMSH2突变质粒。并且构建了含不同hMSH6结构域的重组pGBKT7质粒:pGBKT7-N端结构域、MutS Ⅰ-Ⅳ、MutS Ⅰ-Ⅴ、MutS Ⅱ-Ⅳ、MutSⅡ-Ⅴ、MutS Ⅲ-Ⅳ、MutSⅢ-V。结果显示,酵母AH109双杂交转化子pGADT7-hMSH2/pGBKT7-hMSH6-MutS Ⅱ-Ⅴ、pGADT7-hMSH2/pGBKT7-hMSH6-MutSIII-V分别在组氨酸缺陷的培养基上长出。这说明hMSH6蛋白的MutSⅡ-Ⅴ、MutSⅢ-Ⅴ结构域分别与hMSH2蛋白在酵母AH109中具有弱的双杂交作用,产生弱的蛋白质相互作用。由此,我们以pGBKT7-hMSH6-MutS Ⅱ-Ⅴ和pGADT7-hMSH2在酵母AH109的相互作用为基础建立hMSH2/hMSH6相互作用平台,对9个hMSH2错义突变进行功能评估。结果显示,与野生型hMSH2相比较,hMSH2c.505A>G、c.1168C>T、 c.1255C>A、c.1261C>A突变体在组氨酸缺陷的培养基上生长正常;hMSH2c.1223A>G. c.1886A>G、c.2108C>A、c.2516A>G突变体在组氨酸缺陷的培养基上生长缓慢;hMSH2c.518T>G和c.1664delA突变体在组氨酸缺陷的培养基上不生长。为了进一步研究,我们拟以免疫共沉淀法研究hMSH2与hMSH6相互作用。用基因重组的方式构建免疫共沉淀质粒pCMV-Myc-hMSH2、pCMV-HA-hMSH6。在本实验中,我们将pCMV-Myc-hMSH2、pCMV-HA-hMSH6共转染293T细胞。提取细胞抽提液,进行Western blot分析。结果证实pCMV-Myc-hMSH2在293T细胞中成功表达hMSH2蛋白。可是由于出现杂带干扰,pCMV-HA-hMSH6的western blot检测未完成。 pCMV-HA-hMSH6在293T细胞中表达与否有待进一步研究。我们进一步综合了文献中对9个错义突变的功能分析结果。包括保守位点分析、氨基酸改变分析、蛋白质结构模拟以及病例对照分析。有8个突变的功能分析和本实验酵母双杂交结果一致。只有hMSH2c.1255C>A与本实验酵母双杂交结果不一致。至此,本实验初步建立了l(?)MSH2/hMSH6(?)互作用的酵母双杂交平台。并在此基础上对9个hMSH2错义突变进行了功能评估。hMSH2c.1223A>G. c.1886A>G、c.2108C>A、c.2516A>G部分影响了hMSH2/hMSH6(?)目互作用,可能对hMSH2的细胞活性产生负面影响。hMSH2c.518T>G则对hMSH2/hMSH6相互作用造成重大影响,为病理性突变。而hMSH2c.505A>G、c.1168C>T、c.1255C>A、 c.1261C>A则对hMSH2/hMSH6相互作用未见不利影响。第二部分:AluYb8MUTYH与乳腺癌及胃癌发病易感性关系研究DNA氧化损伤在肿瘤形成中起到了重要作用。在多种DNA氧化损伤产物中,8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)是最为常见的一种氧化损伤。研究表明碱基切除修复机制(BER)能够有效切除8-OHdG,在DNA氧化损伤修复中发挥关键作用。其中BER系统中的hMUTYH酶,在DNA复制后切除子链DNA中与母链8-OHdG错配的A,从而使错配的8-oxoG:A形成8-oxoG:C的配对。已有研究表明,hMUTYH基因的遗传性缺陷与结直肠癌发病相关。本实验室在以往的工作中发现hMUTYH基因的15内含子中存在AluYb8插入变异,在人群中呈多态分布。且实验结果表明,与AluYb8MUTYH的A/A(AluYb8双缺失型)或者A/P(杂合型)基因型的个体相比AluYb8MUTYH的P/P基因型(AluYb8双插入型)的个体的白细胞基因组DNA中具有高8-OHdG水平。在本研究中,我们着重筛查AluYb8MUTYH在两种一般性肿瘤乳腺癌及胃癌中的频率分布。通过病例-对照研究,探讨这些变异与肿瘤发病易感性之间的关系。在本研究中,我们对545例乳腺癌病人、762例胃癌病人及相匹配的正常人进行AluYb8MUTYH突变筛查。结果显示,癌症患者的AluYb8MUTYH等位基因频率增加,但没有达到显著性差异。在小于55岁的乳腺癌病人中AluYb8MUTYH(P)等位基因频率显著高于正常女性(p=0.042;OR=1.26;95%CI,1.01-1.56)其中小于55岁的乳腺癌病人中A/A基因型频率显著小于正常女性(P=0.014;OR=1.51;95%CI,1.09-2.08)。这暗示了AluYb8MUTYH在乳腺癌中是以显性模式起作用的。在小于55岁的胃癌病人中AluYb8MUTYH (P)等位基因频率显著高于正常对照(p=0.042;OR=1.37;95%CI,1.02-1.85)。其中小于55岁的胃癌病人中P/P基因型频率显著大于正常对照(P=0.019;OR=1.81;95%CI,1.10-2.98)。这暗示了AluYb8MUTYH在胃癌中是以隐性模式起作用的。本实验结果表明,AluYb8MUTYH等位基因频率与中国人群中胃癌和乳腺癌的早期发病相关。在胃癌和乳腺癌患者中进行AluYb8MUTYH的突变筛查有着重要意义。