研究背景:弥漫大B细胞淋巴瘤在成人患者中非霍奇金淋巴瘤最常见的亚型。在当前的化疗方案下,只有10%的患者能达到完全治愈。根据以往的研究显示,大多数患者存在染色体异常,包括c-Myc、Bcl-2、Bcl-6基因的易位和扩增。其中,c-Myc高表达的DLBCL是发病机制不明、进展迅速、耐化疗、治愈率低的难治性淋巴瘤之一,其中,c-Myc高表达的DLBCL与耐药、疾病进展密切相关,而其机制尚不清楚,是亟待解决的问题。因此,深入研究高表达c-Myc的DLBCL的发病机制对于提高耐药及复发难治治疗水平具有重要意义。深入研究高表达c-Myc的DLBCL的发病机制和发展有效的治疗方法是必要的。然而,c-Myc是一种天然无序蛋白,缺乏药物识别位点,目前针对c-Myc的药物难以避免选择性弱、副作用大。因此,针对c-Myc的抗肿瘤药物的开发具有挑战性,目前仍难以攻克。c-Myc是癌基因,不仅调节肿瘤生长和分化,而且是能量代谢的关键调控因子,是DLBCL的重要治疗靶点。近年来,在肿瘤能量代谢的研究中发现了一个很有前景的现象,即细胞能量代谢的迅速剥夺至一个临界以下可触发自噬性死亡,而不是适应性的自噬反应。自噬细胞死亡多发生在各种癌症中。在以往的研究中,抑制MYC可诱导Burkitt淋巴瘤细胞系发生自噬细胞死亡,但具体机制尚不清楚。抗抑郁药maputiline和氟西汀联合也会诱导耐药Burkitt淋巴瘤细胞发生自噬性死亡。在多发性骨髓瘤中,二甲双胍可通过AMPK/m TOR通路诱导细胞自噬性死亡。这种类型的细胞死亡分别对抗癌效果和肿瘤细胞耐药性有良好的贡献作用。因此,靶向自噬可能为克服耐药提供一种新的潜在治疗策略。然而,细胞自噬性死亡在其他血液病肿瘤中却鲜有报道。我们首次发现靶向c-Myc会诱导高表达c-Myc的DLBCL细胞系发生自噬性死亡。因此,阐明靶向c-Myc诱导c-My高表达的DLBCL细胞发生自噬性死亡的潜在分子机制,识别与c-Myc相关的靶点基因等,对于个体化精准治疗和良好预后至关重要。正如早期提到的,有证据表明,自噬性细胞死亡作为一种新型的肿瘤细胞死亡方式,可能成为一种具有治疗潜力的新型治疗方式。自噬性细胞死亡作为一种新型的肿瘤细胞死亡可能是一个很有治疗潜力的治疗方式。我们前期研究显示我们之前的工作发现,人类正辅助因子4（PC4）在各种癌症中上调,并可调节自噬影响疾病的进展和治疗。通过生物信息学分析,我们发现PC4在DLBCL中异常高表达。我们还发现PC4可能是乳腺癌中c-Myc的上游调控因子。考虑到c-Myc在DLBCL中的关键作用,阐明PC4在DLBCL中的潜在作用和潜在分子机制是至关重要的。在本研究中,我们首次报道了PC4在DLBCL中高表达,与c-Myc蛋白表达呈正相关。进一步研究,PC4敲低可诱导c-Myc高表达的DLBCL细胞发生自噬性死亡,这是一种新型的细胞死亡方式。我们还发现,抑制c-Myc介导的有氧糖酵解和过度激活AMPK/m TOR信号通路是导致c-Myc高表达的DLBCL中PC4敲低诱导细胞自噬死亡的原因。此外,PC4通过结合至c-Myc启动子区域发挥其致癌功能。我们的研究为PC4在c-Myc高表达的DLBCL中的作用和机制提供了新的见解,提示PC4可能是一种很有前途的治疗靶点。此外,我们通过生物信息分析发现,在DLBCL中PC4与MALAT1存在强相关性,接下来的分子生物学实验验证了MALAT1可以通过磷酸化激活GSK3β与β-catenin促进DLBCL细胞的增殖。研究方法与结果:1.PC4在c-Myc高表达的DLBCL患者标本及细胞系中显著上调,并与患者预后不良密切相关。为了探讨PC4的潜在临床意义,我们首先分析了PC4在弥漫性大B细胞淋巴瘤标本中与相邻正常组织的表达水平。癌组织中PC4水平较高,而邻近的正常组织中PC4水平较低。PC4表达的平均染色评分证实了上述结果。然后,我们分析了c-Myc蛋白阳性表达或低表达的DLBCL标本中PC4的表达情况,发现与c-Myc（-）组织相比,c-Myc（+）组织中PC4的平均染色评分显著升高。另外,我们对患者肿瘤组织中PC4的m RNA表达进行比较,发现患者肿瘤组织中PC4的m RNA表达明显高于正常组织。此外,我们分析了c-Myc（+）组织和c-Myc（-）组织的PC4 m RNA的表达水平,发现c-Myc（+）组织的PC4 m RNA表达高于c-Myc（-）组织。以上数据提示,在DLBCL中,PC4表达水平可能与c-Myc表达水平呈正相关。同时,通过对公共癌症数据库中159例和414例DLBCL（分别为GSE4475和GSE10846）的分析,我们发现PC4表达水平较高的组总体生存率较低。通过对上述临床标本的患者基本信息进行分析发现,c-Myc的表达在性别、年龄、亚型、Ki-67表达的基础上没有显著变化,但c-Myc高表达患者具有较高Ann Arbor分期和较差的无事件生存率以及BCL-2、BCL-6、P53蛋白高表达。最后,我们检测了非癌性淋巴细胞细胞系（CCRF-SD）和DLBCL细胞系（DOHH2、DCL-LY10、HBL-1、TMD8）中PC4和c-Myc的蛋白水平,结果显示PC4和c-Myc在TMD8和HBL-1细胞中的表达明显高于其他细胞系。q PCR和免疫荧光染色检测证实,与非癌性淋巴细胞系（CCRF-SD细胞）相比,DLBCL细胞系（DOHH2、DCL-LY10、TMD8和HBL-1细胞）中PC4的m RNA和蛋白水平均上调。综上所述,这些结果表明,PC4是DLBCL中潜在的癌基因,与c-Myc呈正相关。2.体外和体内沉默PC4可诱导弥漫大B细胞淋巴瘤发生细胞凋亡为了研究PC4表达增加在DLBCL中的功能意义,我们使用TMD8和HBL-1细胞进行后续的功能缺失研究。通过特异性sh RNA（sh PC4#1和sh PC4#2）建立稳定的PC4敲除细胞系。CCK-8检测表明PC4敲除会抑制细胞的增殖。在PC4沉默的细胞系（TMD8和HBL-1细胞）中通过western blotting检测凋亡蛋白,发现PARP、c-caspase 3、BCL-2表达升高。基因集富集分析显示,TMD8细胞系中,低表达PC4（sh PC4）的HALLMARK＿APOPTOSIS基因集富集较对照组明显增高,说明PC4沉默可诱导细胞凋亡。PC4的下调也抑制了TMD8和HBL-1细胞的集落形成能力。我们在显微镜下观察到PC4敲除后TMD8和HBL-1细胞系中有细胞空泡和细胞碎片形成。此外,TEM图像显示,在TMD8和HBL-1细胞PC4敲低后,会有自噬空泡形成。这些发现表明PC4的下调与自噬有关。此外,我们建立了皮下异种移植模型来研究PC4在体内的生物学功能。将稳定的PC4敲除的TMD8细胞接种到雄性裸鼠皮下。在体内实验中,与sh-NC组和对照组相比,sh-PC4#1组的异种移植物生长受到显著抑制。PC4敲除降低了实验终点处肿瘤的平均重量和大小。此外,PC4的敲除对小鼠体重没有显著影响。此外,下调PC4可诱导cleaved PARP的表达和LC3II的表达,同时也降低了SQSTM1的表达,提示下调PC4可诱导细胞凋亡和自噬。综上所述,提示PC4可促进DLBCL细胞增殖,下调PC4在体内外均可诱导细胞凋亡和自噬。3.抑制PC4可诱导c-Myc高表达的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞过度自噬而引发凋亡文献表明,由于细胞能量严重不足,会发生了非选择性自噬。正如预想的那样,沉默PC4可以诱导TMD8和HBL-1细胞中LC3II的表达和SQSTM1蛋白的下调。我们还检测了不加任何处理的所有细胞系（包括CCRF-SD、DOHH2、DCL-LY10、HBL-1、TMD8细胞）的自噬水平,发现它们之间无显著差异。PC4沉默后,相关的自噬蛋白（beclin1、ULK1、ATG7）也上调。此外,TEM图像显示PC4敲除细胞中有自噬空泡形成,3MA可以逆转这一现象。接着我们发现,在PC4沉默表达GFP-LC3的TMD8和HBL-1细胞中观察到GFP-LC3斑点,3MA显著抑制了它们的存在。上述数据表明,PC4敲除可诱导自噬。PC4敲低显著抑制TMD8和HBL-1细胞的增殖,而3MA部分逆转了这一现象。同样,3MA也能逆转细胞凋亡。我们使用si RNA抑制ATG7蛋白的表达。有趣的是,si ATG7显著逆转了LC3II和裂解PARP的水平。si ATG7也可以逆转TMD8和HBL-1稳定的PC4敲低细胞的细胞增殖。因此,我们的结果证实了PC4敲低可以诱导TMD8和HBL-1细胞自噬性死亡。为了评估PC4敲低在低表达的DLBCL细胞系和非癌性淋巴细胞细胞系中的作用,我们建立了特异性sh RNA在c-Myc低表达细胞系（DOHH2和DCL-LY10）和非癌性淋巴细胞细胞系（CCRF-SD）中敲低PC4。我们发现在上述细胞中,抑制PC4对LC3II水平和裂解PARP和细胞增殖没有影响。这些结果表明,PC4抑制只能在c-Myc高表达的DLBCL细胞系（TMD8和HBL-1）中诱导自噬性细胞死亡。4.TMD8细胞中PC4靶基因全基因组分析我们对TMD8细胞系进行全基因组分析,比较PC4稳定敲除或不敲除的TMD8细胞系的基因表达谱,探讨PC4抑制DLBCL细胞增殖和诱导凋亡的潜在机制。热图显示,PC4敲低后,包括c-Myc在内的4个基因表达降低,36个基因表达增加。我们在TMD8稳定PC4敲低细胞中鉴定了12669个潜在的PC4靶基因,在对照细胞中鉴定了13082个,其中有12172个基因在TMD8稳定PC4敲低细胞和对照细胞之间重叠。然后,我们分析了稳定敲除PC4的TMD8细胞和对照细胞中PC4和c-Myc m RNA表达的差异,结果显示,敲除PC4后,c-Myc显著降低。此外,我们使用KEGG功能通路分析显示,这些常见的信号通路发生改变,包括AMPK信号通路,和PI3K-Akt信号通路。PC4敲除后AMPK信号通路激活最明显（激活3个基因）,PI3K-Akt信号通路受到抑制最明显（抑制3个基因）。此外,我们建立了GO分析来了解PC4的完整功能,结果显示PC4可以正向调节DLBCL的代谢过程和细胞过程。因此,PC4可能通过调节代谢促进DLBCL的增殖。5.在DLBCL细胞系中,PC4敲低会抑制AMPK/m TOR信号通路诱导自噬根据全基因组分析的数据,我们通过western blot验证了m TOR信号通路及其下游蛋白（4EBP1和S6K1）,结果显示PC4敲低后其磷酸化水平显著下降。然后我们检测了m TOR上游信号通路,包括AMPK、P53、P38和AKT,结果发现AMPK磷酸化水平相对于其他蛋白升高较多。GSEA结果显示,与PC4low（sh PC4）相比,HALLMARK＿MTORC1＿SIGNALING在对照组细胞系中富集。为了深入了解PC4在DLBCL中的作用,我们下一步进行了相关的挽救实验。AMPK信号通路抑制剂Dorsomorphin（化合物C）用于TMD8和HBL-1稳定PC4敲低细胞中。令人惊讶的是,我们发现,在TMD8和HBL-1稳定PC4敲低细胞中,Dorsomorphin会部分逆转LC3II和裂解PARP的表达水平。Dorsomorphin也部分逆转细胞增殖,表明PC4敲除引起的应激对DLBCL的细胞存活有负面影响。先前的研究表明,上述途径的改变与能量代谢的下降有关。因此,我们接下来进行了相关代谢研究。6.PC4的下调会抑制TMD8和HBL-1细胞系的糖酵解代谢从而诱导自噬。为了进一步阐明PC4在DLBCL中的潜在机制,我们进行了代谢相关的实验。我们发现,PC4敲除后,2-NBDG的摄取以及乳酸和ATP的产生被显著抑制。正如预期的那样,反映糖酵解通量的细胞外酸化速率（ECAR）也在TMD8稳定PC4敲低细胞系中下降。此外,PC4的沉默抑制了糖酵解的关键酶GLUT1、PKM2、HK2和LDHA的表达。GSEA结果显示,在TMD8细胞系中,与PC4low（sh PC4）相比,HALLMARK＿GLYCOLYSIS基因组在PC4high（对照组）中富集。为了证实PC4在糖酵解中的作用,我们接下来在稳定的PC4敲低细胞系中过表达GLUT1。如预期的那样,过表达GLUT1后细胞存活率和集落形成能力得到部分逆转。我们发现过表达GLUT1可部分降低AMPK磷酸化水平以及裂解的PARP和LC3II的表达。这些发现表明,PC4敲低引起的应激与糖酵解代谢相关。7.PC4通过直接调控c-Myc转录来实现其癌基因功能既往研究表明,糖代谢是由c-Myc和HIF-1促进因子调控的。然后我们对c-Myc和HIF-1的表达进行western blotting和q-PCR验证,发现,稳定的PC4敲低细胞系中c-Myc蛋白和m RNA水平显著下降。GSEA结果显示,与PC4low（sh PC4）相比,HALLMARK＿MYC＿TARGETS＿V1在PC4high（对照组）细胞株中富集。c-Myc的高表达与DLBCL患者的不良预后相关,而c-Myc在肿瘤的糖酵解调节中发挥重要作用。因此,我们利用特异性质粒在PC4敲除细胞中过表达c-Myc。正如预期的那样,我们发现过表达c-Myc可显著挽救因PC4敲低而引起的细胞凋亡和增值受抑。此外,上调c-Myc还可以在很大程度上挽救细胞外酸化速率（ECAR）、2-NBDG的摄取和ATP的产生。正如预想的那样,c-Myc过表达挽救了糖酵解的关键酶包括GLUT1和LDHA的抑制。最后,过表达c-Myc可以下调AMPK磷酸化水平和上调m TOR、4EBP1和S6K1磷酸化水平。综上所述,这些结果表明PC4通过c-Myc发挥其癌基因功能。为了进一步证明PC4与c-Myc的关系,我们随后研究了PC4是否可以直接激活c-Myc转录促进其表达。通过生物信息学和Jasper等软件预测发现c-Myc启动子上有PC4和c-Myc两个结合位点,BS:结合位点,BS1:CCAACAAATGCAATGGGAGT,BS2:CAGGAGGGGCGGTATCTG。我们进行了双荧光素酶报告基因检测,结果显示PC4通过c-Myc启动子中的两个PC4结合位点调控c-Myc转录。然而,电泳迁移移分析（EMSA）和染色质免疫沉淀（Ch IP）证实PC4只与c-Myc的第一个结合序列相关,而与BS2结合序列无关。为了进一步验证BS1是唯一的PC4和c-Myc DNA结合位点,我们对TMD8和HBL-1细胞系进行了BS1点突变构建,结合位点突变序列为:TTGGTGGGCATGGCAAAGAC。此外,我们在BS1 MUT探针上进行EMSA,结果证实BS1是唯一的DNA结合位点。与预期的一样,BS1突变细胞系中c-Myc蛋白和m RNA水平均下降。此外,c-Myc稳定敲低后,PC4的蛋白和m RNA水平没有显著影响。以上实验结果表明,PC4作为c-Myc的上游基因,直接调控c-Myc转录,发挥其致癌功能。8.MALAT1在DLBCL中的作用。研究长链非编码RNA MALAT1在DLBCL的作用及其分子机制。选择SU-DHL-1和SU-DHL-4在培养基中培养,通过质粒过表达和敲除MALAT1。与对照组相比,过表达MALAT1显著增加Brd U阳性细胞比例和细胞增殖。MALAT1敲除组Brd U阳性细胞比例及细胞增殖明显降低。细胞凋亡比例明显增加。MALAT1通过GSK3β的磷酸化和β-catenin的活化促进了DLBCL细胞的增殖。结论:在本研究中,我们首次报道了PC4在DLBCL中的表达模式、诊断和预后价值。此外,PC4作为c-Myc的直接上游调控因子,可通过阻断c-Myc介导的有氧糖酵解和能量供应,激活c-Myc（+）DLBCL中的AMPK/m TOR信号,诱导自噬细胞死亡。因此,我们的研究为PC4在c-Myc（+）DLBCL中的作用和机制提供了新的见解,提示PC4可能是治疗c-Myc（+）DLBCL的一个新的靶点。研究结果显示PC4可能是治疗c-Myc（+）DLBCL的一个新的靶点,为PC4在c-Myc（+）DLBCL中的作用和机制研究提供了新的依据。