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本实验的目的在于通过使用微卫星DNA检测荷斯坦牛的遗传多态性,进而建立一种适用于牛的亲子鉴定体系。微卫星DNA(又称短串联重复序列,或简单重复序列)是以1~6bp的短核苷酸为基本单位,首尾相连组成的串联重复序列。大多数重复单位是二核苷酸,也有少量含有1、3至6个核苷酸的重复单位,重复次数一般在5次以上,可高达100次,片段长度通常在400bp以下。微卫星DNA由其核心序列和两侧的侧翼序列构成,侧翼序列使某一微卫星特异定位在染色体的一定位置,核心序列重复数的不同是构成微卫星多态性的基础。大于10次重复的微卫星DNA序列具有高度的种属多态性,从植物到脊椎动物这种多态性有很大的差别。正是由于微卫星DNA序列具有长度多态性的特点,它可用来对动物进行亲子鉴定。本文选用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)联合推荐的用于牛遗传分析的12个微卫星基因座,利用PCR和聚丙烯酰胺电泳银染技术对来自不同牛场的100头荷斯坦牛进行了遗传多态性检测。12个STR基因座的杂合度、多态信息含量、有效等位基因数的均值为0.8711、0.8574、8.1666,这些基因座的遗传杂合度及多态信息含量高,均为高度多态位点,12个STR的累积非父排除概率为99.999999%,适用于动物的遗传分析和个体鉴定。应用这12个微卫星基因座对三种不同情况的36头不同家系的荷斯坦牛进行了亲子鉴定:第一种情况是给定父母双方与子代,排除一方父母的情况;第二种情况是给定父母双方与子代,排除父母双方的情况;第三种情况是给定一方父母与子代,排除其具有亲缘关系的情况。结果显示三种不同情况下都能成功认定其生物学亲缘关系,因此这12个微卫星位点可以用作亲权鉴定的微卫星标记组合。本实验还对多重PCR的反应条件进行了探索,成功地优化到了该12个基因座四组三重PCR反应条件。四组分别为:组合1: ETH10-BM1824-ETH225组合2:BM1818-INRA023-CSSM66组合3:ILSTS006-THLA53-INRA037组合4: INRA063-HEL9-TGLA126利用多重PCR可以对动物进行遗传分析,但因微卫星片段长度大多为100-300bp,且位点多态性高,同一位点片段长度在不同群体中跨度大,所以在多重PCR的结果分析图上,非特异性条带多,或者有条带重叠而导致判读错误。因此在亲子鉴定中,如果不能使用荧光多重PCR进行分析,那么还是单个位点的PCR分析结果更适合于亲子鉴定。一般认为微卫星DNA多态性产生的原因是DNA复制和修复过程中的碱基的滑动、错配或减数分裂过程中姊妹染色单体的不均等交换。通过测序分析了其中一个微卫星位点不同基因型的重复单元,测序结果显示:分析结果与理论值一致。