维奈托克联合达沙替尼对白血病细胞株SUPB15增殖和凋亡的影响及相关机制的研究

来源 :山西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:b411574103
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目前关于费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia,Ph+ALL)的治疗还需要不断的进行探索,已有的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)在治疗Ph+ALL时的作用时间比较短暂,而且会出现耐药性,因此我们需要找到能够增加TKIs活性的药物。B细胞淋巴瘤因子-2(B cell lymphoma 2,BCL-2)在大多数血液肿瘤(包括Ph+ALL)中高表达,因为其具有抗凋亡的作用,所以能够诱导肿瘤的发生。维奈托克(Venetoclax,VEN)作为一种特异性的BCL-2抑制剂,因此在治疗血液肿瘤时能够起到很好的作用,已经被证实在慢性髓系白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)、急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)中能够取得很好的治疗效果,且已证实与TKIs联用可起协同作用,但该药针对急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)的相关研究较少,尤其针对Ph+ALL。本论文主要就维奈托克与达沙替尼联用在Ph+ALL细胞株中的效果及其相关机制进行探讨。目的:探讨BCL-2抑制剂-维奈托克(VEN)、酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)达沙替尼(Dasatinib,DAS)单独去使用以及对两药进行联合使用,观察其对SUPB15细胞的增殖情况与凋亡反应及其相关机制。方法:(1)96孔板进行体外培养的SUPB15细胞经VEN(VEN单药组)、DAS(DAS单药组)、两药联合(DAS+VEN联合用药组),进行干预,并设置不加药阴性对照组,每组设置6个重复孔,观察SUPB15细胞株24h、48h、72h,使用CCK8法测定细胞增殖抑制率。(2)采用流式细胞术(FCM)在48h时间节点检测DAS组、VEN组及两药联合组的凋亡情况。(3)Q-PCR检测DAS单药组、VEN单药组及两药联合作用干预SUPB15细胞株后,相关基因BCR-ABLm RNA、BCL-2m RNA、MCL-1m RNA、LYNm RNA、BIMm RNA、STAT5m RNA、BAXm RNA表达。(4)采用蛋白质检测法(Western-blot)分析DAS单药组、VEN单药组及两药联合使用组对SUPB15细胞株干预后,相关蛋白BCL-2、MCL-1、STAT5、BAX、BIM、LYN蛋白的表达情况以及检测凋亡相关的标志性蛋白Cleaved-Caspase-3(CC-3)的水平。结果:(1)CCK-8结果表明:在24h、48h、72h三个时间节点,VEN单药组(0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L),DAS单药组(0.001μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)。伴随着时间延长以及浓度的增加,利用酶标仪检测到的吸光值越来越低,说明药物作用于细胞之后,细胞的存活率降低,药物对细胞的抑制率升高,且呈时间-剂量依赖性,单药作用组与联合作用组与对照组比较差异均具有统计学意义。DAS单药组在各时间点(24h、48h、72h)的IC50值分别为0.13μmol/L、0.08μmol/L、0.01μmol/L,VEN单药组在各时间点(24h、48h、72h)的IC50值分别为:1.24μmol/L、0.39μmol/L、0.07μmol/L。计算在48h VEN联合DAS(0.5μmol/L+0.1μmol/L)的q值为1.16,q值>1.15,表明两药具有协同或增敏作用。(2)FCM结果表明:根据CCK8实验结果,选用48h时间节点,选接近IC50值的联合组研究浓度,即:DAS 0.1μmol/L、VEN 0.5μmol/L及两药联合。流式仪检测细胞凋亡率,联合用药组的平均凋亡率(57.42±0.59)%,显著高于对照组,亦高于各单药组(p<0.05),差异具有统计学意义。(3)Q-PCR结果表明:当DAS单药组浓度为0.1μmol/L、VEN单药组浓度为0.5μmol/L及联合组浓度为0.1μmol/L DAS+0.5μmol/L VEN时,干预SUPB15细胞株48h后,相关基因BCR-ABL、LYN、STAT5、BCL-2、MCL-1 m RNA的相对表达量较对照组下降(P值<0.05,差异具有统计学意义),而BIM、BAX m RNA的相对表达量较对照组上升,联合用药组与单药组比较BCR-ABL、LYN、STAT5、BCL-2、MCL-1 m RNA的下降量及BIM、BAX m RNA的上升量更明显,差异具有统计学意义(p<0.05)。(4)Western-blot结果表明:单药组(0.1μmol/L DAS、0.5μmol/L VEN)及联合组(0.1μmol/L DAS+0.5μmol/L VEN)干预SUP15细胞株48h,与对照组比较,LYN、BCL-2、MCL-1、STAT5蛋白的表达量下降,而BAX、BIM以及CC-3表达增加,联合用药组的LYN、MCL-1、BCL-2蛋白与单药组相比显著下降(P<0.05);联合用药组中STAT5的表达较VEN单药组明显下降,与DAS单药组比较虽无统计学意义(P>0.05),但具有一定下降趋势;与对照组相比,BAX蛋白、BIM蛋白以及CC-3的表达在各实验组中均明显升高(P<0.05,差异有统计学意义),联合用药组的BAX的表达与各单药组比较有显著差异(P<0.05),联合组BIM的表达虽不具统计学差异(P>0.05),但是具有一定的增加趋势。结论:(1)VEN、DAS单药对SUPB15细胞株均有增殖抑制作用,并呈时间剂量依赖性;(2)VEN、DAS单药对SUPB15细胞株均有促凋亡作用;(3)VEN与DAS联用干预SUP15细胞株具有协同抑制作用作用和促进凋亡,可能的机制为DAS可以下调MCL-1的表达,上调BAX、BIM,从而增强VEN的作用效果。
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