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研究背景糖尿病肾病是糖尿病最严重的慢性并发症之一,目前已成为全世界范围内慢性肾脏病和终末期肾病的首要原因。但临床缺乏有效的治疗手段,因此早期干预极为重要。足细胞是肾小球滤过屏障的最关键部分,足细胞损伤是糖尿病肾病发生、发展及临床干预的关键。最近的研究提示,肾脏炎症是糖尿病肾病发病的关键因素。cGAS-STING通路是免疫和炎症中的一个重要信号分子,通过识别胞浆内的外源DNA、自身异常DNA,与目的基因的启动子结合,促进炎症基因的表达,在代谢相关炎症中起重要作用。然而,该通路是否参与糖尿病肾病的发生目前尚不清楚。第一部分cGAS-STING信号通路在糖尿病肾病小鼠肾损伤进程中的表达与激活目的探究db/db小鼠肾功能改变的时间进程和cGAS-STING信号通路在db/db小鼠肾实质细胞中的激活情况。方法1.使用db/db小鼠作为糖尿病肾病模型,以db/m小鼠作为对照。从4周龄开始监测,每周测量小鼠体重和空腹血糖,每两周随机处死两组的各三只小鼠,收集血清和肾脏组织。2.通过肾脏组织石蜡切片HE染色、PAS染色、Masson染色、TUNEL染色、nephrin蛋白IHC染色,透射电镜,小鼠血尿素氮、血肌酐、血脂测定,GTT和ITT的结果综合分析db/db小鼠糖尿病肾病损伤进程。3.通过IF共定位探索cGAS-STING信号通路主要发挥作用的细胞。通过western blotting检测cGAS-STING通路在db/db小鼠糖尿病肾病损伤进程中的激活情况。结果1.10周龄db/db小鼠的体重和空腹血糖均高于对照组,并伴有血脂异常、糖耐量受损和胰岛素敏感性受损。2.db/db小鼠在10周龄时开始出现明显的微量白蛋白尿,血尿素氮和血肌酐水平正常,肾脏病理表现为肾小球明显肥大,系膜轻度扩张,没有明显纤维化改变,足细胞标志蛋白nephrin表达降低,出现广泛融合的足突和不规则增厚的肾小球基底膜,足细胞凋亡水平增加。3.大约8周龄的db/db小鼠肾皮质中检测到cGAS-STING通路的激活,主要在足细胞中。肾皮质中cGAS和STING蛋白水平升高,TBKI磷酸化水平升高,IRF3磷酸化和IFN-β的水平保持不变。结论1.足细胞损伤是糖尿病肾病的主要早期表现。2.db/db小鼠肾脏cGAS-STING通路的激活主要在足细胞中。3.db/db小鼠肾脏cGAS-STING通路的激活先于足细胞损伤。4.cGAS-STING通路在足细胞中的激活方式为STING-TBK1,不激活IRF3。第二部分体内抑制STING改善糖尿病肾病小鼠足细胞损伤的探究目的探究抑制cGAS-STING通路是否可以改善糖尿病肾病和肥胖相关肾病。方法1.给予7周龄db/db小鼠腹腔注射STING抑制剂C-176,每天一次,连续21天,监测并记录小鼠体重、血糖、尿蛋白的变化。收集血清和肾脏组织,检测肾功能及肾脏形态改变,检测方法同第一部分。2.建立饮食诱导的肥胖小鼠（DIO）模型,给予腹腔注射STING抑制剂C-176,隔天一次,连续28天,监测并记录小鼠的体重、血糖、尿白蛋白肌酐比的变化。收集血清和肾脏组织,检测肾功能及肾脏形态改变,检测方法同第一部分。结果1.C-176抑制了 cGAS-STING通路激活。C-176干预不影响db/db小鼠体重、ITT、GTT、血脂结果,降低了空腹血糖。在C-176治疗的第一周,微量白蛋白尿显著减少,血尿素氮和血肌酐的水平没有改变。肾小球肥大和系膜扩张在C-176治疗后得到改善,nephrin水平升高,足细胞凋亡减轻,足细胞排列有序,足突清晰,肾小球基底膜均匀。2.cGAS-STING通路在DIO小鼠足细胞中激活。C-176抑制了 cGAS-STING通路激活。DIO小鼠出现体重增加、糖耐量和胰岛素耐量异常、空腹血糖升高、尿白蛋白肌酐比增加,肾小球肥大和系膜扩张、nephrin水平降低、肾小球基底膜弥漫性增厚、足细胞数量减少、足突广泛融合、足细胞凋亡增加,C-176干预改善了 DIO小鼠肾脏表型。结论1.抑制cGAS-STING通路改善db/db小鼠足细胞损伤。2.抑制cGAS-STING通路改善DIO小鼠足细胞损伤。3.抑制STING的肾脏保护作用并不仅仅是因为它们减轻了肥胖或全身代谢,因为:（1）C-176减轻了 db/db小鼠的肾损伤,而没有显著改善高血糖、血脂异常或肥胖;（2）C-176对DIO小鼠的肾保护作用先于其对血糖水平的影响。第三部分cGAS-STING信号通路介导MPC5细胞损伤的机制研究目的阐明抑制cGAS-STING通路对足细胞损伤的保护作用是否是细胞自主的,并探讨其潜在的分子机制。方法1.用棕榈酸（palmitic acid,PA）诱导小鼠足细胞系MPC5细胞损伤,通过western blotting 和 IF 染色检测 cGAS-STING 激活情况,通过 western blotting 检测足细胞的标志蛋白nephrin和podocin的水平,通过TUNEL染色和western blotting检测细胞凋亡水平,通过q-PCR检测炎症因子表达水平。2.分别用STING抑制剂C-176、STING小干扰RNA、TBK1抑制剂GSK8612干预PA损伤的MPC5细胞,检测cGAS-STING激活情况和细胞损伤情况,检测方法同上。3.通过Seahorse和透射电镜检测PA损伤的MPC5细胞线粒体功能及形态以及EtBr干预的PA损伤的MPC5细胞线粒体功能及形态。用mtDNA转染MPC5细胞,检测cGAS-STING激活情况和细胞损伤情况。4.分别用BAX抑制剂BAI1、BAX小干扰RNA、线粒体通透性转换孔抑制剂环孢霉素A干预PA损伤的MPC5细胞,检测cGAS-STING激活情况和细胞损伤情况。结果1.PA刺激后,MPC5细胞中cGAS-STING激活,STING下游分子TBK1和NF-kB p65的磷酸化水平升高,IRF3没有被磷酸化,IFN-β的蛋白水平保持不变。足细胞标志蛋白nephrin和podocin水平下降,凋亡水平增加,炎症因子IL-6和TNF-α表达增加。2.C-176、STING 小干扰 RNA、GSK8612 干预降低了 TBK1 和 NF-kB p65磷酸化,nephrin和podocin蛋白水平部分恢复,细胞凋亡减少,IL-6和TNF-α水平降低。3.PA降低了 MPC5细胞基础和最大线粒体呼吸速率,减少了 ATP生成。线粒体结构破坏、基质空泡形成。随着PA浓度的增加,自噬小体数量减少。EtBr干预改善了 PA诱导的足细胞损伤。mtDNA转染的MPC5细胞中cGAS-STING激活,诱导了足细胞损伤,这些损伤可以被C-176显著减轻。4.BAI1、BAX小干扰RNA干预抑制了 cGAS-STING激活,减轻了足细胞损伤。而环孢霉素A没有起到这种作用。结论1.在脂毒性相关的足细胞损伤中,C-176或STING基因敲除的保护作用是细胞自主的,与动物实验一致。2.cGAS-STING通路在MPC5细胞中的激活方式为STING-TBK1-p65,而不激活IRF3,与动物实验一致。3.GSK8612抑制TBK1足以产生细胞自主保护作用,表明TBK1是足细胞中cGAS-STING通路的重要效应下游分子。4.足细胞自噬受损导致损伤线粒体的堆积,mtDNA通过bax介导的大孔泄漏到细胞质中,激活cGAS-STING/TBK1/p65通路,导致炎症因子的产生和足细胞损伤。