基于miRNAs对关节软骨代谢及疼痛的调节机制研究养血柔肝法治疗骨关节炎的作用机理

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhaobaodong2006
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目的:  明确养血柔肝法“养血软坚胶囊”治疗骨关节炎的相关机制是否与miRNAs对软骨代谢及疼痛的调节有关,进而探索及补充养血柔肝法治疗骨关节炎的现代科学机制。  方法:  将60只SD大鼠随机分为空白组(N=20)、模型组(N=20)和中药组(N=20),并对模型组和中药组大鼠进行ACLT造模成骨关节炎模型,模型验证造模成功后,予中药组大鼠灌胃饲养,药物采用基于养血柔肝法治则的养血软坚胶囊。4周后统一取材,取材包括关节软骨,血浆,背根神经节和腰椎脊髓背角。关节软骨进行病理切片、染色,并通过Mankin评分进行比较,分析三组实验动物软骨破坏情况。采用LCM技术捕获目标区域软骨细胞,并对其进行Western-Blot检测,分析MMP-3、MMP-13、Col2a1、GAPDH等蛋白的表达,并比较其灰度值。提取关节软骨组织的RNA,制备文库,使用FASTX工具包对数据进行预处理,过滤的测序序列用Bowtie工具得到miRNA表达值矩阵,miRanda鉴定差异表达的miRNA的靶基因,利用DAVID工具对差异表达的靶基因进行GO的富集分析和Pathway富集分析,构建网络图。并RT-PCR验证所得结果。通过RT-PCR检测血浆,背根神经节和腰椎脊髓背角组织的相关miRNAs表达。  结果:  空白组关节软骨表层基本光滑,表层未出现破坏,软骨细胞数量正常,个别染色较轻,少见裂缝形成,无血管翳样组织生成,软骨潮线基本完整。模型组关节软骨表层部分不平整,甚至有几处出现软骨软化现象,软骨细胞数量较空白组增多,且排列无序,并向软骨外层迁移,且部分出现细胞簇集现象,软骨钙化层增厚,有微裂隙出现,有的甚至出现血管翳样组织,着色较重。中药组关节软骨表面不平整,甚至出现软骨表层破损现象,软骨细胞较多且排列紊乱,基质淡杂。中药组MMP13与MMP3的表达下调而Ⅱ型胶原的表达明显上调,并共有35个miRNAs表达有差异。其中7个上调(共调控了1174个靶基因),28个下调(共调控了2216个靶基因);对差异miRNAs的靶基因进行蛋白互作网络分析(PPI)后,明确连接度最高的几个节点为JUN、RHOA、CTNNB1、POLR2K、APP等,并获得了19个重要的靶基因。且三组关节软骨、血浆、DRG、腰椎脊髓背角中的miR-199a-5p,miR-142-5p,miR-140-3p,miR-485-5p,miR-300-3pand miR-9a-3p表达均有差异,有统计学意义。  结论:  养血柔肝法中药“养血软坚胶囊”很可能是通过对miR-199a-5p,miR-142-5p,miR-140-3p,miR-485-5p,miR-300-3p and miR-9a-3p等的调控以起到治疗骨关节炎的作用。
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