G蛋白偶联受体（G protein-coupledreceptor,GPCR）,又称为七次跨膜受体,是目前已知的人类基因组中最大的膜受体家族。在人类基因组中,大约有800多个基因编码GPCR,负责80%左右的跨膜信号转导,参与调控人体中大多数生理与病理过程,目前临床上30%以上的处方类药物都是靶向GPCR发挥作用。GPCR位于质膜上,能够识别各种细胞外刺激,包括光子、离子、小分子、肽和蛋白质等,并将产生的细胞外信号通过G蛋白及arrestin转变为细胞内信号。在这个过程中,G蛋白主要是通过调节细胞内第二信使的水平来发挥作用;而arrestin则是通过招募不同的下游蛋白,使受体发生脱敏、内吞或启动arrestin介导的信号转导途径。然而,人类基因组只编码16种Gα蛋白和4种arrestin,这些数字远远低于与它们相互作用的众多受体数量。其中,每个信号传感器（比如arrestin）如何实现将不同受体介导的信号转化为下游效应而行使不同的生物学功能仍不清楚。GPCR招募arrestin之前通常会被GPCR激酶（GRKs）磷酸化,它产生不同的磷酸化模式调控arrestin行使不同的功能。目前已知,arrestin主要通过两种方式与GPCR结合,一种是仅与受体磷酸化的C末端结合的“悬挂构型”（hanging）:另一种是同时与受体的磷酸化C末端和受体七次跨膜螺旋核心结合的“紧密构型”（snuggly）。然而,在“悬挂构型”中GPCR单个磷酸化位点是如何调控arrestin的构象和功能以及磷酸化受体如何调控arrestin的动态构象分布仍不清楚;在“紧密构型”中,GPCR如何调控arrestin发挥作用依然是该领域的难点及热点。配体是否可以不依赖于受体的磷酸化,而直接通过与受体结合,调控受体的构型,来实现arrestin功能的特异性指导,是一直以来悬而未决的谜题。在本文研究中,针对以上科学问题我们利用X-ray晶体学、DeSipher和BRET等方法证明了“悬挂构型”中GPCR C末端尾部单个的磷酸化位点对arrestin远端功能结构域构象的调控作用,并发现了重要的时序效应;同时我们利用DeSipher发现针对同一受体,多种配体可以与GPCR的七次跨膜核心（TM Core）作用并直接调控arrestin的构象改变从而介导下游不同的功能;我们还利用基因密码子扩展技术将发展的硒探针整合到arrestin中,探究了磷酸化GPCR调控arrestin动态构象的变化及分布。首先,我们利用X-ray晶体学和基于基因密码子扩展技术的DeSipher技术研究了 GPCR的C末端单个不同磷酸化位点通过直接作用于arrestin而引起arrestin远端的构象变化,并利用BRET证明了其构象变化与其生物学功能的选择相关性,发现了磷酸化编码过程中具有重要的时序效应。我们设计合成了加压素2型受体（V2R）的C末端不同磷酸化模式的短肽（V2Rpp-1、-3、-4、-6-7）,利用热稳定实验证明了 Fab30能够提高不同磷酸化短肽与arrestin复合物的稳定性,因此我们将4种不同磷酸化模式的V2RC末端短肽（V2Rpp-1、-3、-4、-6-7）与arrestin和Fab30共孵育重组复合物进行结晶,通过X-ray衍射我们解析了原子水平分辨率的arrestin结合不同磷酸化短肽的复合物结构。通过结构对比分析,我们发现磷酸化短肽不同的磷酸化位点突变失去了其与arrestin结合口袋的相互作用,并引起arrestin远端不同功能域的构象变化。比较有趣的是,我们发现T360的磷酸化缺陷,不仅破坏了 pS357和pT360与其结合口袋的相互作用,还导致磷酸化短肽的中段发生了明显的构象重排,pS357翻向外侧,失去了与arrestin K11、K160、K138和R165的作用,而朝向外侧的pT359发生了 180°的翻转而朝向内侧,与arrestin的K11和R25重新形成氢键网络等,我们将新发现的结合作用口袋命名为“V3’4’”。与非激活态的arrestin结构比较发现,不同磷酸化模式的短肽激活arrestin,均能引起arrestin远端功能结构域的亲水暴露面积发生相应改变。同时,与V2Rpp-FP激活态arrestin结构相比,V2Rpp-1、-3、-4、-6-7激活态的arrestin在多处功能相关结构区域形成不同的结构构型。那么这些产生构象变化的区域是否与受体不同的磷酸化编码调控arrestin的生物学功能具有相关性?为进一步验证GPCR磷酸化对arrestin构象的调控作用,我们通过基因密码子拓展技术在arrestin与MEK和c-Raf-1相互作用区域标记了一维氢谱核磁探针4-三甲基硅烷基苯丙氨酸（TMSiPhe）,能在低蛋白浓度、短时间内获取探针标记区域的动态构型变化信息。借助950 MHz NMR,1H-NMR的化学位移展示了arrestin在不同的磷酸化短肽作用下的多种动态构象变化。我们的研究发现,在V2Rpp-1和V2Rpp-3作用下的arrestin2-R307TMSiPhe的S2状态的构象明显少于V2Rpp-FP,而V2Rpp-4和V2Rpp-6-7的磷酸化缺陷则不会引起arrestin的S2构象,全部处于 SO 构象。Arrestin2-K357TMSiPhe 在 V2Rpp-FP 和 V2Rpp-1 的作用下,全部处于M2构象状态,不同的是V2Rpp-3、V2Rpp-4和V2Rpp-6-7作用下的arrestin则出现了一种新的M3构象。核磁检测结果说明,GPCR单个磷酸化位点缺陷可诱导arrestin与MEK1和c-Raf-1相互作用区域产生特异的多种动态构象变化,可直接影响arrestin远端功能结构域的构型。为了揭示arrestin在不同磷酸化短肽作用下的构象多样性是否与arrestin介导的生物学功能具有相关性,我们对V2R的C末端不同磷酸化位点进行了相关的突变,利用FlAsH-BRET实验检测了依赖V2R磷酸化的arrestin与MEK1、c-Raf-1的相互作用。结果显示,V2R C末端不同磷酸化修饰的位点突变引起的受体磷酸化模式差异可不同程度地影响arrestin对MEK1、c-Raf-1的招募能力。这说明,GPCR磷酸化引起激活态arrestin的构象差异可引起arrestin不同的信号传导,从而调控arrestin发挥功能。受体不同的磷酸化编码模式在调控arrestin与下游蛋白c-Raf-1和MEK1的相互作用中扮演着重要角色。为了研究受体的七次跨膜核心区对arrestin构象的调控作用,我们利用基因密码子扩展技术将新发展的硅探针TMSiPhe选择特异性地插入到arrestin的polar core（H295）和与ERK作用位点（R285）。经过质谱鉴定,我们成功的在arrestin的特异位点插入了核磁探针TMSiPhe,并通过X-ray晶体学解析了 TMSiPhe和TMSiPheRS酶的复合物结构,揭示了 TMSiPheRS对TMSiPhe的特异性选择识别机制。结合950 MHz 1H-NMR,我们发现针对同一受体,多种配体可以与GPCR的七次跨膜核心（TM Core）作用并直接调控arrestin的构象改变,从而介导下游不同的功能,我们将这种创新性技术命名为“DeSipher”。我们还将DeSipher技术应用到arrestin的下游蛋白clathrin中,检测了磷酸化受体调控arrestin介导的clathrin多种构象变化。为了获得GPCR调控arrestin的动态构象分布,我们同时发展了硒探针SeF并应用于smFRET,检测了磷酸化GPCR调控下游蛋白arrestin的动态构象分布。首先我们开发了新的FRET荧光对:Bodipy593-FlAsH-EDT2,然后利用基因密码子扩展技术选择特异性的将非天然氨基酸SeF插入到arrestin的特定位点,通过取代反应将荧光染料Bodipy593特异性标记到SeF,从而实现将Bodipy593在arrestin上的定点标记作为受体,在arrestin的特异位点插入了 CCPGCC用以标记FlAsH-EDT2来作为供体。我们在Sf9昆虫细胞中表达纯化的GPCR通过转肽酶Sortase A连接了人工合成的短肽GGG-V2Rpp-FP,实现了 GPCR的均一磷酸化,最后借助TIRF荧光显微镜,进行smFRET检测磷酸化GPCR调控arrestin的不同动态构象状态分布。该方法创新性地利用基因密码子扩展技术将硒探针SeF整合到arrestin的特定位点来特异性标记Bodipy593,相比传统的Cy3-Cy5标记方法,避免了 arrestin蛋白中所有的半胱氨酸突变,SeF-Bodipy593和FlAsH以更短的linker实现了染料对蛋白的特异性标记,更容易精准地检测出arrestin在激活前后微小的构象变化及其状态分布。综上所述,通过上述实验我们解析了四种不同磷酸化模式的V2R C端短肽与arrestin的复合物晶体结构,发现单个磷酸化位点缺陷可以引起arrestin远端生物学功能域的构象变化,结合DeSipher和BRET等技术手段,证明了 GPCR单个磷酸化位点缺陷即可引起arrestin远端功能结构域产生不同的构象变化,并发现了其与arrestin生物学功能的相关性,揭示了 GPCR单个磷酸化位点对arrestin动态构象多样性及功能的磷酸选择调控机制。这种单个的磷酸化结合模式在不同的磷酸化编码结合口袋中是相互依赖、相互串联的,并且在磷酸化编码过程中具有重要的时序效应,这也是决定arrestin特殊的构象变化及功能选择性的主要机制,为研究arrestin动态构象多样性及分布和功能的磷酸选择机制提供了直接证据。我们利用新发展的DeSipher技术首次证明配体对arrestin的调控可以不依赖于对GRK的选择,这一发现澄清了多年以来GPCR领域内对应有配体有效的操纵arrestin功能的怀疑,并为未来发展arrestin和G蛋白的偏好性配体提供了重要的指引。同时我们发展了能够特异性标记Bodipy593的硒探针,并应用于smFRET,检测了磷酸化GPCR调控arrestin的不同动态构象状态分布,为研究GPCR调控下游蛋白的动态构象变化及分布提供了一种新方法。