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目的1.探讨微型抗肌萎缩蛋白（mini-dystrophin）基因在杜氏肌营养不良症（DMD）模型（mdx）小鼠体内长期表达对肌肉生理功能的影响。2.构建同时包含mini-dystrophin基因和NF-κB/p65-shRNA的载体质粒并通过三质粒共转染法包装腺相关病毒（AAV）。3.探讨基因替代治疗联合抗炎治疗（Dual-cassette）策略在重度DMD模型（homo）小鼠体内的治疗效果。方法1.通过转基因mdx（Tg-mdx）小鼠和基因敲除小鼠之间的繁育,获得不同基因型的小鼠模型,并利用聚合酶链反应（PCR）和免疫荧光（IF）检测其基因型和表型。2.蛋白免疫印迹（Western Blot）和IF检测6、10和20月龄Tg-mdx小鼠背长肌和腓肠肌中dystrophin、肌聚糖（α、β和γsarcoglycan）、肌养蛋白（dystrobrevin）、互生蛋白（α1-syntrophin）和神经元型一氧化氮合酶（n NOS）的表达情况。3.Evans Blue Dye（EBD）染色检测Tg-mdx小鼠腓肠肌中肌细胞膜的完整性。通过小鼠跑步机和前肢握力实验来评估Tg-mdx小鼠整体和上肢的肌肉耐力改善情况。4.构建pAAV（ss）-U6-p65shRNA-Mcken-Syn-hOptiDys3978载体质粒,通过三质粒共转染293细胞的方法包装AAV9-U6-p65shRNA-Mcken-Syn-hOptiDys3978病毒,纯化并测定病毒滴度。5.将5日龄的实验小鼠分成4组:正常组（C57BL/6J小鼠）、实验组（homo小鼠,dual-cassette）、实验对照组（homo小鼠,single-cassette）和空白组（homo小鼠）,每个分组包括5只小鼠。按照AAV注射标准流程及实验分组,分别给予实验组小鼠腹腔注射AAV9-U6-p65shRNA-Mcken-Syn-hOptiDys3978 50μl（1×1011 viral particles）,实验对照组小鼠腹腔注射AAV9-Mcken-Syn-hOptiDys3978 50μl（1×1011viral particles）,空白组小鼠腹腔注射50μl PBS。6.Western Blot和IF检测不同基因型小鼠肌肉中dystrophin蛋白的表达情况,并分析dystrophin蛋白的表达与炎症细胞浸润水平的关系。Masson’s Trichrome染色检测不同基因型小鼠肌肉纤维化程度。7.Western Blot和IF检测正常组、实验组、实验对照组和空白组小鼠不同组织中dystrophin蛋白的表达情况和炎症细胞浸润水平。肌肉生理功能检测评估AAV治疗对homo小鼠骨骼肌功能的影响。结果1.根据实验设计,得到实验所需不同基因型小鼠。Tg-mdx组:dys-/-;utro+/+;Tg+。Tg-homo组:dys-/-;utro-/-;Tg+。homo组:dys-/-;utro-/-。homo-p65组:dys-/-;utro-/-;p65+/-。Tg-homo-p65组:dys-/-;utro-/-;p65+/-;Tg+。2.IF结果表明mini-dystrophin基因可以在Tg-mdx小鼠骨骼肌中长期高效表达,但是在心肌中未表达。Western Blot和IF结果表明Tg-mdx小鼠在6、10和20月龄时肌肉组织中sarcoglycans、dystrobrevin、α1-syntrophin和n NOS的表达水平比mdx小鼠显著增加。3.IF和EBD染色结果表明Tg-mdx小鼠腓肠肌中mini-dystrophin基因的表达可以降低中央型细胞核的肌细胞比例并提高细胞膜完整性。小鼠跑步机实验和前肢握力测试结果表明6月龄Tg-mdx小鼠的跑步距离和前肢握力较同龄mdx小鼠明显增加,与同龄WT小鼠相比差异无统计学意义。同时,肌肉生理功能检测表明在6、10和20月龄时Tg-mdx小鼠胫骨前肌的绝对强直收缩力和比力较同龄mdx小鼠增加。4.构建的载体质粒同时包含mini-dystrophin基因和NF-κB/p65-shRNA,并成功利用293细胞包装AAV9。Mini-dystrophin基因由肌酸激酶（MCK）增强子和肌肉特异性合成（Syn）启动子引导,NF-κB/p65-shRNA由U6启动子引导。5.Western Blot和IF结果表明Tg-homo-p65组小鼠肌肉组织中的炎症细胞浸润水平与Tg-homo组和homo-p65组相比明显下降。Masson’s Trichrome染色结果表明Tg-homo-p65组小鼠肌肉组织的纤维化程度与Tg-homo组和homo-p65组相比也明显减轻。6.Western Blot和IF结果表明实验组小鼠肌肉组织的炎症细胞浸润水平与实验对照组和空白组相比明显下降。肌肉生理功能检测结果表明:homo小鼠在接受AAV治疗后2月,实验组小鼠胫骨前肌的肌肉功能要明显高于实验对照组和空白组。结论1.Mini-dystrophin基因在mdx小鼠体内长期表达可以改善小鼠肌肉组织的病变程度并提高肌肉生理功能。2.AAV作为载体可以同时介导mini-dystrophin基因和NF-κB/p65-shRNA在homo小鼠体内的表达。3.AAV9介导的基因替代和抗炎双靶点治疗策略可以下调homo小鼠肌肉组织的炎症水平,缓解肌肉病变程度,同时提高肌肉生理功能。