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[目 的]全世界6.9%-10%的人患有神经病理性疼痛（Neuropathic pain,NP）,目前缺乏有效的治疗方法。低强度聚焦超声（Low intensity focus ultrasound,LIFU）可以激活中枢神经系统,但是否可以激活脊髓神经环路并调控神经病理性疼痛仍不清楚。本研究旨在通过LIFU对脊髓进行刺激,探讨LIFU激活脊髓神经环路的有效性和安全性,以及LIFU刺激脊髓调控神经病理性疼痛的作用和可能的分子机制。[方 法]本研究分为两个部分:第一部分:低强度聚焦超声刺激脊髄的有效性和安全性研究1.1.LIFU刺激脊髓的有效性研究:通过不同声压强度（Acoustic pressure intensity,API）和不同占空(每个API刺激20 s,每个API刺激间隔5 min。肌电图（Electromyogram,EMG）记录比目鱼肌（Soleus,Sol）肌电信号;1.2.LIFU刺激脊髓的安全性研究。①不同API安全性研究:采用DC=20%+API（API=0 MPa,API=0.5 MPa,API=1.5MPa,API=3.0MPa）的 LIFU 刺激 L4-L5脊髓,时间20 min;②不同DC安全性研究:采用API=0 MPa,API=0.5 MPa+DC（DC1=20%,DC2=33%,DC3=50%）,API=1.5MPa+DC（DC1=20%,DC2=33%,DC3=50%）的LIFU刺激L4-L5脊髓,时间20 min。运动功能评分（Basso Beattie Bresnahan,BBB）评估大鼠运动功能;体感诱发电位（SEP,Somatosensory evoked potential）和运动诱发电位（MEP,motor evoked potential）检测脊髓电生理;肉眼检查脊髓大体形态;Tunel染色检测细胞凋亡;苏木精—伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,H＆E）、Nissl染色观察脊髓组织结构和神经细胞;蛋白免疫印迹（Western Bloting,WB）检测脊髓组织Caspase3、Bcl2的表达;免疫荧光（Immunofluorescence,IF）染色检测脊髓组织内C-fos、GAD65的表达。第二部分:低强度聚焦超声调控神经病理性疼痛的有效性和机制研究2.1.LIFU刺激L4-L5脊髓平面调控神经病理性疼痛的有效性:选择性结扎坐骨神经术（spared nerve injury,SNI）建立周围神经损伤性（peripheral nerve injurie,PNI）神经病理性疼痛大鼠模型。采用不同超声参数（LIFU1+,API=0.5MPa,DC=20%;LIFU2+,API=0.5 MPa,DC=33%;LIFU3+,API=1.5 MPa,DC=20%）刺激L4-L5脊髓,阴性对照组（LIFU-,API=0MPa）给予超声假刺激,阳性对照组（Drug Group）给予加巴喷丁（1 mg/200 g）灌胃治疗。治疗方案:20min/次,1次/天,持续4周。通过50%机械性缩足阈值（50%paw withdrawal threshold,PWT50）评估大鼠后肢疼痛阈值;2.2.神经病理性疼痛大鼠建模成功后随机分为2组（LIFU+组和LIFU-组）,按2.1方案,采用超声参数（API=0.5MPa,DC=20%）刺激两组大鼠L4-L5脊髓。PWT50对两组大鼠的疼痛进行评估,最后一次刺激和PWT50评估结束后,取L4-L5平面脊髓组织行转录组检测;2.3.神经病理性疼痛大鼠建模成功后随机分为4组:Normal组,Sham组,PNI+LIFU+组,PNI+LIFU-组。按2.1治疗方案治疗4周。PWT50评估大鼠的疼痛阈值;WB、IF检测脊髓组织中KCC2、p-CREB、p-ERK、CaMK Ⅳ、干扰素调节因子 9（Interferon Regulatory Factor 9,IRF9）、Caspase3、Bcl2、GFAP的表达;Tunel检测脊髓中神经细胞凋亡;2.4.成功建立神经病理性疼痛大鼠模型后,在建模后1天、3天、5天、7天、2周时间点,采用WB、IF检测脊髓组织中IRF9、Caspase3、Bcl2和GFAP的表达;Tunel检测脊髓中神经细胞凋亡;2.5.通过在SD大鼠L4-L5脊髓注射IRF9敲低/过表达慢病毒（LV3-IRF9-/LV5-IRF9+）,对照组注射IRF9敲低/过表达慢病毒空载病毒（LV3-NC/LV5-NC）,空白对照组注射PBS。慢病毒注射1周、3周后WB、IF检测脊髓组织IRF9、Caspase3、Bcl2、GFAP的表达;Tunel检测脊髓中神经细胞凋亡;2.6.SD大鼠L4-L5脊髓注射IRF9敲低/过表达慢病毒（LV-大鼠）1周后,建立PNI性神经病理性疼痛大鼠（LV-PNI大鼠）模型,依据不同处理方式将LV-PNI 大鼠随机分为 6 组（Normal组,PBS-PNI 组,LV3NC-PNI 组,LV3IRF9--PNI 组,LV5NC-PNI 组,LV5IRF9+-PNI 组）。建模第 2 周后,WB、IF 检测脊髓组织中IRF9、Caspase3、Bcl2的表达,Tunel检测凋亡神经细胞。[结果]第一部分:低强度聚焦超声刺激脊髓的有效性和安全性研究1.1.API≥0.5 MPa时,LIFU刺激脊髓可以激活大鼠脊髓神经环路,并诱发后肢比目鱼肌（Sol）肌电信号;相同占空下,随着声压强度增强,Sol肌电信号增强,EMG振幅值增高（P＜0.05）;相同声压强度下,随着占空增加,Sol肌电信号增强,EMG振幅值增高（P＜0.05）;1.2.API=1.5MPa,DC=20%,或 API=0.5MPa,DC=20%、33%＆50%时,LIFU刺激未引起脊髓损伤;超声刺激组大鼠脊髓大体形态观察、H＆E和Nissl染色、SEP和MEP检测、Caspase3和Bcl2表达、凋亡细胞数等与假刺激组比较差异不具有统计学意义（P＞0.05）;1.3.在 API=3.0 MPa、DC=20%,或 API=1.5 MPa、DC=50%＆33%时,LIFU 刺激引起脊髓出血,H＆E、Nissl染色显示脊髓后角结构紊乱,SEP振幅值降低（P＜0.05）,Caspase3、Bcl2 表达升高（P＜0.05）,Tunel 阳性细胞数增加（P＜0.05）,GFAP免疫组化染色星形胶质细胞表达增强（P＜0.05）;第二部分:低强度聚焦超声调控神经病理性疼痛的有效性和机制研究2.1.建立神经病理性疼痛模型后,大鼠PWT50阈值降低（P＜0.05）;LIFU刺激3周后,LIFU1+组与LIFU-组比较PWT50增加（P＜0.05）,与药物组比较PWT50无统计学差异（P＞0.05）;LIFU治疗4周后,LIFU2+与LIFU-刺激组比较PWT50增加（P＜0.05）,LIFU3+组与LIFU-组比较PWT50无统计学差异（P＞0.05）;2.2.转录组检测结果显示,LIFU+组与LIFU-组差异表达基因328个,其中下调基因216个,上调基因112个;超声刺激治疗后,关键基因Slc12a5（KCC2,FC=1.851,Padjust=0.013）表达上调,Irf9（FC=0.404,Padjust=0.048）、Gfap（FC=0.483,Padjust=0.000）表达下调;2.3.超声刺激4周后,WB、IF检测显示,与Normal组比较,LIFU-组KCC2、Bc12 表达出现了下调（P＜0.05）,p-CREB、p-ERK、CaMK Ⅳ、IRF9、GFAP、Caspase3等表达出现了上调（P＜0.05）,Tunel阳性细胞出现了增加（P＜0.05）;与 LIFU-组比较,LIFU+组 KCC2、Bcl2 表达出现了上调（P＜0.05）,p-CREB、p-ERK、CaMK Ⅳ、IRF9、GFAP、Caspase3 等表达出现了下调（P＜0.05）,Tunel阳性细胞数出现了降低（P＜0.05）;2.4.建立神经病理性疼痛模型3天后,脊髓组织内GFAP表达开始增加（P＜0.05）;建模第5天后,脊髓组织内IRF9、Caspase3表达开始增加（P＜0.05）,Bcl2表达开始降低（P＜0.05）,脊髓组织中Tunel 阳性细胞增加（P＜0.05）。2.5.脊髓注射IRF9敲低/过表达慢病毒后,脊髓组织内IRF9的表达较PBS组和慢病毒空载组出现下调/上调（P＜0.05）,而脊髓内Caspase3、Bcl2、GFAP的表达则无明显统计学差异（P＞0.05）;2.6.与 PBS-PNI 组和 LV3NC-PNI 组比较,LV3IRF9--PNI 组大鼠脊髓内 Caspase3表达出现了降低（P＜0.05）,Bcl2的表达出现了增加（P＜0.05）,Tunel阳性细胞数出现了降低（P＜0.05）;与PBS-PNI组和LV5NC-PNI组大鼠相比,LV5IRF9+-PNI组则出现了 Caspase3显著增加（P＜0.05）,Bcl2显著降低（P＜0.05）,Tunel阳性细胞数显著增加（P＜0.05）。[结论]1.API≥0.5MPa后,低强度聚焦超声可以有效激活脊髓神经环路,并引起Sol肌电信号;在相同占空下,随着超声声压增加,Sol肌电信号增强;在相同超声声压下,随着占空增加,Sol肌电信号增强;2.API=1.5 MPa,DC=20%,或 API=0.5 MPa,DC=20%、33%＆50%,刺激 20 min,LIFU是一种安全的脊髓刺激方式;当API=3.0 MPa,或API=1.5 MPa、DC=50%＆33%,刺激20 min,LIFU刺激可引起脊髓损伤;3.API=0.5 MPa,DC=20%时,LIFU刺激脊髓可以增加神经病理性疼痛大鼠PWT50阈值;其分子机制可能是通过下调脊髓内p-CREB、CAMK Ⅳ蛋白的表达,并上调KCC2的表达;4.LIFU刺激脊髓可能对NP大鼠脊髓内神经性炎症反应起到抑制作用,并抑制神经细胞的凋亡;LIFU抑制NP大鼠脊髓内神经细胞凋亡则可能是通过降低脊髓神经元细胞内IRF9的表达;5.IRF9与神经病理性疼痛大鼠脊髓神经细胞凋亡相关,敲低IRF9可抑制神经病理性疼痛大鼠脊髓内神经元的凋亡,过表达IRF9则可促进神经病理性疼痛大鼠脊髓内神经元的凋亡;