【摘 要】
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研究背景:目前,治疗良性气道狭窄的主要手段是纤维支气管镜引导的呼吸介入治疗,但是,仍有很多患者出现复发。肉芽组织的反复增生是其最重要的因素。维拉帕米是苯烷类钙离子拮抗剂,在皮肤瘢痕性疙瘩、神经跟腱损伤、尿路损伤性狭窄、牙龈增生纤维化中有防治作用,但对气道狭窄的气道肉芽成纤维细胞的抑制研究甚少。目的:本研究主要是建立人正常气道成纤维细胞和人气道肉芽成纤维细胞的细胞模型,探索正常与肉芽成纤维细胞之间的
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研究背景:目前,治疗良性气道狭窄的主要手段是纤维支气管镜引导的呼吸介入治疗,但是,仍有很多患者出现复发。肉芽组织的反复增生是其最重要的因素。维拉帕米是苯烷类钙离子拮抗剂,在皮肤瘢痕性疙瘩、神经跟腱损伤、尿路损伤性狭窄、牙龈增生纤维化中有防治作用,但对气道狭窄的气道肉芽成纤维细胞的抑制研究甚少。目的:本研究主要是建立人正常气道成纤维细胞和人气道肉芽成纤维细胞的细胞模型,探索正常与肉芽成纤维细胞之间的差异,钙通道阻滞剂维拉帕米对人气道肉芽成纤维细胞的抑制作用,为临床使用钙通道阻滞剂防治良性气道狭窄提供实验依据。方法:1.气道成纤维细胞模型的建立:使用人肺支气管组织、人气道肉芽组织进行气道成纤维细胞原代培养。使用不同抗生素方案处理组织防止污染:方案1,使用抗生素DMEM高糖培养基混合液:使用2%PS、25μg/ml两性霉素B混合液浸泡2h,50μg/ml庆大霉素浸泡2h,方案2,使用多种抗生素DMEM高糖培养基配制液分次处理并提高PS浓度:10%PS、25μg/ml两性霉素B混合液浸泡2h,50μg/ml庆大霉素浸泡1h,75μg/ml左氧氟沙星浸泡1h。采用两种方法进行细胞培养:组织块培养法,组织块+酶消化法。2.人正常气道成纤维细胞和人气道肉芽成纤维细胞的鉴定:使用波动蛋白（Vimentin）抗体对第三代细胞进行鉴定。3.维拉帕米对人气道肉芽成纤维细胞的抑制作用:使用不同浓度的维拉帕米对人正常气道成纤维细胞和人气道肉芽成纤维细胞的处理,从形态学上比较两者的差别。采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）比色法测试维拉帕米对人正常气道成纤维细胞及人气道肉芽成纤维细胞的半抑制浓度;使用流式细胞术测试维拉帕米对人气道肉芽成纤维细胞的凋亡作用;使用划痕实验检测维拉帕米对人气道肉芽成纤维细胞的迁移的抑制作用;使用PCR检测人正常气道成纤维细胞与人气道肉芽成纤维细胞之间相关因子的m RNA相对表达量的差别,人气道肉芽成纤维细胞经过维拉帕米处理后,相关因子的m RNA相对表达量的变化;Western blot测试人正常气道成纤维细胞与人气道肉芽成纤维细胞之间相关蛋白的相对表达量的差别,人气道肉芽成纤维细胞经过维拉帕米处理后,相关蛋白的相对表达量的变化。结果:1.气道成纤维细胞模型的建立:抗生素处理方案2污染率低于方案1（P＜0.05）,差异存在统计学意义;组织块培养法成功率高于组织块+酶消化法（P＜0.05）,差异存在统计学意义。2.人正常气道成纤维细胞和人气道肉芽成纤维细胞的鉴定:第3代细胞进行波动蛋白（Vimentin）抗体鉴定,为阳性,纯度超过95%。3.维拉帕米对人气道肉芽成纤维细胞的抑制作用:当维拉帕米浓度为70μg/ml时,对人气道肉芽成纤维细胞的形态学影响比较明显,而对人正常气道成纤维细胞的影响不大。CCK8检测维拉帕米对人正常气道成纤维细胞的半抑制浓度为92.81μg/ml,对人气道肉芽成纤维细胞的半抑制浓度为69.57μg/ml。流式细胞术测试维拉帕米对人气道肉芽成纤维细胞的凋亡作用,使用半抑制浓度的维拉帕米处理,人气道肉芽成纤维细胞的凋亡率高于对照组,差异存在统计学意义（P＜0.05）。PCR结果显示,人气道肉芽成纤维细胞中,TGF-β1,COL1A1,Smad2/3,VEGFA,IL-6,IL-8等m RNA的相对表达量明显高于人正常气道成纤维细胞（P＜0.05）。人气道肉芽成纤维细胞经过半抑制浓度的维拉帕米处理48h后,TGF-β1,Smad2/3,COL1A1等m RNA的相对表达量是下调的（P＜0.05）,VEGFA,IL-6,IL-8的m RNA表达量无明显变化（P＞0.05）。WB的检测中表明,TGF-β1,Smad2,VEGFC的蛋白相对表达量在人气道肉芽成纤维细胞中明显高于人正常气道成纤维细胞（P＜0.05）,人气道肉芽成纤维细胞经过半抑制浓度维拉帕米处理后,TGF-β1,Smad2,VEGFC的蛋白相对表达量下调的（P＜0.05）。结论:组织块培养法是进行气道成纤维细胞原代培养的可行方法。提高抗生素浓度并联合多种抗生素浸泡组织能有效杀灭组织病原体。维拉帕米可以抑制人气道肉芽成纤维细胞的增殖,可能成为防治良性气道狭窄的方法。
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