论文部分内容阅读
背景和目的:乳腺癌在我国全部的女性恶性肿瘤中的发病率较高,而且近些年来发病率有明显升高的趋势。肿瘤细胞具有增殖速度快、凋亡减少、转移能力强等特点,这也是恶性肿瘤转移和发展迅速的重要原因。另外,肿瘤细胞的能量代谢与正常细胞不同。正常细胞只有在氧气缺乏的条件下才以糖酵解途径供能,而肿瘤细胞在氧气充足条件下也优先以糖酵解方式供能,这种特殊的能量代谢途径被称为“有氧糖酵解”,也称为“Warburg”效应。肿瘤细胞特殊能量代谢途径同样与肿瘤中异常表达的基因有关。lncRNA是一类长度超过了 200bp的无编码蛋白质作用的RNA,在机体内的细胞质以及细胞核中存在,不含有开放阅读框,lncRNA能够经转录以及转录后调控和表观遗传学等复杂作用影响基因表达过程。lncRNA在基因的转录、RNA的剪切、X染色体失活和人类很多疾病进程中发挥作用,lncRNA通过剪切并调控基因的表达、竞争性结合等方式发挥阻碍miRNA表达的功能。lncRNA还和人类肿瘤的进展关系密切,已经发现肿瘤内多个lncRNA表达异常,这些表达发生改变的lncRNA既可以作为肿瘤的早期诊断标记物,也能够作为肿瘤治疗的分子靶点。lncRNA MEG3在人类脑和垂体中的表达水平较高,是在人体中发现的印记基因。MEG3在人类多种肿瘤细胞株中表达缺失,如神经胶质瘤、卵巢癌、结直肠癌、肝细胞肝癌等,MEG3表达下降与肿瘤患者的预后、转移、临床病理分期等有关,MEG3还参与调控肿瘤细胞的生长、凋亡和转移等过程,MEG3表达水平的高低与肿瘤关系密切。本次实验包括以下四个部分:第一部分:lncRNAMEG3对乳腺癌细胞增殖、凋亡、转移及Warburg的影响;第二部分:lncRNAMEG3靶向调控miR-21影响乳腺癌进程的机制;第三部分:MEG3过表达逆转miR-21介导的PI3K/AKT通路在乳腺癌细胞中的激活;第四部分:上调MEG3通过下调miR-21抑制乳腺癌细胞体内肿瘤生长。第一部分 lncRNA MEG3对乳腺癌细胞增殖、凋亡、转移及Warburg的影响方法:1.采用qRT-PCR方法分析检测收集的40例乳腺癌组织以及与其相对应的癌旁组织内MEG3的表达差异。2.采用qRT-PCR方法分析检测乳腺癌MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-453,T47D细胞以及正常的乳腺上皮MCF-10A细胞内MEG3的表达差异。3.分别在乳腺癌细胞内转染pcDNA-MEG3,然后采用qRT-PCR方法分析检测上调的效果,使用MTT方法分析检测细胞增殖水平的变化,使用克隆形成实验分析检测细胞克隆能力的变化,使用流式细胞术分析检测细胞凋亡水平的变化,使用Transwell小室分析检测细胞迁移以及侵袭水平的变化,使用Western blot 方法分析检测 N-cadherin、E-cadherin、LDHA、Vimentin、HK2 蛋白的表达情况,使用试剂盒分析检测葡萄糖的消耗、乳酸的产量以及ATP的水平,使用海马细胞外通量分析仪XF 96分别检测ECAR、OCR水平。结果:1.乳腺癌组织中MEG3表达水平低于正常对应癌旁组织。2.乳腺癌 MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453、T47D 细胞中 MEG3 表达水平低于正常乳腺上皮MCF-10A细胞。3.转染pcDNA-MEG3后的乳腺癌细胞中MEG3表达水平升高,细胞增殖能力降低,细胞的克隆能力减弱,凋亡增多,侵袭以及迁移能力均减弱,细胞内N-cadherin、Vimentin蛋白减少,E-cadherin蛋白增多,葡萄糖的消耗以及乳酸的产量下降,ATP减少,细胞的ECAR水平降低,OCR水平增加,细胞内HK2、LDHA蛋白表达减弱。第二部分 lncRNA MEG3靶向调控miR-21影响乳腺癌进程的机制方法:1.采用靶基因的预测软件对MEG3与miR-21的靶向关系进行分析,然后用双荧光素酶报告系统以及RIP实验分别验证二者的靶向关系。2.采用qRT-PCR方法分析检测了 40例乳腺癌组织和与其对应的癌旁组织内miR-21的表达差异。3.采用qRT-PCR方法分析检测了乳腺癌MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-453,T47D细胞以及正常的乳腺上皮MCF-10A细胞内miR-21的表达差异。4.分别将pcDNA-MEG3、MEG3 siRNA转染到乳腺癌细胞内,然后利用qRT-PCR方法分析检测细胞内MEG3以及miR-21的表达差异。5.在乳腺癌细胞中共转染pcDNA-MEG3和miR-21 mimics,然后利用qRT-PCR方法分析检测了 miR-21的表达差异,使用MTT方法分析检测细胞增殖水平的变化,使用克隆形成实验分析检测细胞克隆能力的变化,使用流式细胞术分析检测细胞凋亡水平的变化,使用Transwell小室分析检测细胞迁移以及侵袭水平的变化,使用Western blot方法分析检测N-cadherin、E-cadherin、LDHA、Vimentin、HK2蛋白表达情况,使用试剂盒分析检测葡萄糖消耗、乳酸产量以及ATP水平,使用海马细胞外通量分析仪XF 96分别检测ECAR、OCR水平。结果:1.MEG3可靶向调控miR-21的表达。2.乳腺癌组织内的miR-21的表达较正常的对应癌旁组织升高,乳腺癌组织内MEG3和miR-21的表达呈负相关。3.乳腺癌 MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-453,T47D 细胞中的 miR-21 表达较正常的乳腺上皮MCF-10A细胞升高。4.转染了 pcDNA-MEG3之后的乳腺癌细胞内MEG3的表达增多,miR-21的表达减少;转染了 MEG3 siRNA之后的乳腺癌细胞内的MEG3表达减少,miR-21表达增多。5.转染miR-21 mimics可以部分逆转上调MEG3影响乳腺癌细胞中miR-21表达、增殖、克隆、凋亡、侵袭、迁移、葡萄糖消耗、乳酸产量、ATP合成、ECAR 和 OCR 水平以及 N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、HK2、LDHA 蛋白表达的作用。第三部分MEG3过表达逆转miR-21介导的PI3K/AKT通路在乳腺癌细胞中的激活方法:1.将pcDNA-MEG3、miR-21 mimics分别转染到乳腺癌细胞内,分别给予PI3K/AKT信号通路的激活剂740Y-P、PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002处理,Western blot方法分析检测了细胞内p-AKT以及PI3K蛋白表达。2.在乳腺癌细胞中共转染miR-21 mimics和pcDNA-MEG3,Western blot检测细胞中p-AKT和PI3K蛋白表达变化。结果:1.转染miR-21 mimics后的乳腺癌细胞中p-AKT、PI3K蛋白水平升高,LY294002降低了乳腺癌细胞中p-AKT、PI3K蛋白表达水平。转染pcDNA-MEG3后的乳腺癌细胞中p-AKT、PI3K蛋白水平降低,740Y-P提高了乳腺癌细胞中p-AKT、PI3K蛋白表达水平。2.转染pcDNA-MEG3可以降低上调miR-21后的乳腺癌细胞中p-AKT、PI3K蛋白水平。第四部分 上调MEG3通过下调miR-21抑制乳腺癌细胞体内肿瘤生长方法:1.使用MEG3慢病毒将乳腺癌细胞感染,然后把乳腺癌细胞种植到裸鼠的皮下,然后观察裸鼠移植瘤的生长体积以及重量的变化。2.使用MEG3慢病毒以及miR-21慢病毒将乳腺癌细胞感染,然后把乳腺癌细胞种植到裸鼠的皮下,随后观察裸鼠的移植瘤生长体积以及重量的变化。3.取裸鼠移植瘤组织,qRT-PCR方法检测MEG3、miR-21表达水平。结果:1.MEG3慢病毒感染的乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长体积和重量均明显降低。2.miR-21慢病毒感染可以部分逆转上调MEG3对乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长体积和重量的抑制作用。3.MEG3慢病毒感染了以后的乳腺癌细胞的裸鼠移植瘤组织内MEG3的表达水平明显升高,miR-21表达减少;miR-21慢病毒感染了以后,能够部分将上调MEG3抑制裸鼠移植瘤中miR-21表达的作用逆转。结论:1.MEG3在乳腺癌组织和细胞中表达下调;上调MEG3降低了乳腺癌细胞的Warburg、增殖、侵袭、克隆、迁移、EMT进程,激活了细胞凋亡途径。2.miR-21在乳腺癌组织和细胞中表达上调;MEG3通过负调控miR-21的表达阻碍了乳腺癌细胞的Warburg、增殖、侵袭、克隆、迁移、EMT进程以及促细胞凋亡作用。3.miR-21可激活乳腺癌细胞中PI3K/AKT信号通路;MEG3过表达可逆转miR-21介导的乳腺癌细胞内PI3K/AKT信号通路的激活;MEG3通过下调miR-21抑制乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长。4.lncRNAMEG3 可作为 miR-21 的 ceRNA（competing endogenous RNAs,内源竞争RNA）,通过诱导PI3K/Akt传导途径失活继而抑制乳腺癌细胞体外与体内成瘤效应;MEG3与miR-21可能成为乳腺癌治疗及判断预后的潜在靶点。