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1.研究背景肿瘤干细胞是一群具有自我更新能力、致瘤潜能极强的细胞,它们是造成肿瘤异质性的重要因素。由于肿瘤干细胞的存在,临床治疗肿瘤过程中往往会出现耐药、转移等问题。目前已知肿瘤干细胞的干性来源可能与上皮-间质细胞转化现象(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)、慢性炎症、细胞代谢重编程有关。但其中的肿瘤细胞干性调控机制尚不清楚。有研究发现,肿瘤干细胞的基因组存在拷贝数变异(Copy number variation,CNV),例如:在神经胶质母细胞瘤干细胞中,CNV频率显著高于非肿瘤干细胞。此外,肿瘤干细胞的某些基因存在突变,例如:乳腺癌患者肺转移灶中存在MLF2 R158W、RPL39 A14V、HN1L P20L、HN1L A106V等基因突变;肺癌肿瘤干细胞中存在基因EML4-ALK融合。但上述报道均是以肿瘤整体为研究对象。以单细胞微球形成模型作为肿瘤干细胞的富集模型、并进行大规模基因组测序的研究目前仍比较缺乏。随着单细胞测序技术的发展,我们能够在单细胞水平上,利用多重链置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)方法扩增单细胞基因组,之后对扩增基因组进行文库构建与测序。这一方法使得我们能够精准地对乳腺癌肿瘤干细胞进行热点基因的深度、精准测序。因此,我们选用单细胞体外微球形成模型对乳腺癌肿瘤干细胞进行富集,之后利用MDA扩增技术对单细胞微球和未成球单细胞的基因组分别进行扩增,利用多重聚合酶链式反应(Multiplex Polymerase Chain Reaction,Multiplex PCR)技术构建文库,进行靶向测序,用以研究乳腺癌肿瘤干细胞基因组突变特点。2.研究方法(1)(1)选用人乳腺癌细胞MDA-MB-231单细胞体外微球形成试验,在显微镜下分离单个MDA-MB-231细胞,接种于低粘附96孔板内,在无血清、补充成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,b FGF)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、B-27细胞培养添加剂(B-27)的杜氏改良Eagle培养基:营养混合物F-12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12,DMEM/F-12)培养基中培养单细胞7-10天;(2)对体外所形成的微球进行干性相关表型的验证试验。(2)(1)选取2个非肿瘤干细胞与3个肿瘤干细胞,利用多重链置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)反应方法扩增其全基因组;(2)利用多重PCR技术(Multiplex PCR)对已知肿瘤热点突变靶区进行扩增建库测序;(3)寻找靶区内乳腺癌肿瘤干细胞存在高频突变的基因位点。(3)(1)对乳腺癌肿瘤干细胞高频突变进行基因富集分析。(4)(1)以单细胞体外微球形成试验为模型,对其转录组进行反转录扩增后,构建互补DNA(complementary DNA,c DNA)文库进行测序;(2)对乳腺癌肿瘤干细胞转录组测序数据进行基因差异表达分析;(3)对乳腺癌肿瘤干细胞差异表达基因进行基因通路富集分析。(5)(1)利用Kaplan meier生存分析网站提供乳腺癌患者术后随访信息,对乳腺癌肿瘤干细胞高表达的基因进行生存分析。3.研究结果(1)(1)选用人乳腺癌细胞MDA-MB-231单细胞体外微球形成试验,在显微镜下分离单个MDA-MB-231细胞,接种于低粘附96孔板内,在无血清、补充b FGF、EGF、B-27的DMEM/F-12培养基中培养单细胞7-10天,有大于50μm的单细胞微球形成;(2)对体外所形成的微球进行干性相关表型的验证试验,Western blot和实时荧光定量PCR显示SOX-2,NANOG有明显上调,transwell试验显示细胞体外形成微球侵袭能力显著增强。(2)(1)选取2个非肿瘤干细胞与3个肿瘤干细胞,利用多重链置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)反应方法扩增其全基因组,能够得到扩增均匀完整的全基因组产物;(2)利用多重PCR技术(Multiplex PCR)对已知肿瘤热点突变靶区进行扩增建库测序,测序数据深度较深,数据质量较高;(3)寻找靶区内乳腺癌肿瘤干细胞存在高频突变的基因位点发现有AGXT2等97个基因突变频率显著高于非肿瘤干细胞。(3)(1)对乳腺癌肿瘤干细胞高频突变进行基因富集分析,结果显示乳腺癌肿瘤干细胞高频突变基因与ERBB2信号通路中的GRB2事件显著相关。(4)(1)以单细胞体外微球形成试验为模型,对其转录组进行反转录扩增后,构建c DNA文库进行测序,数据质量较高;(2)对乳腺癌肿瘤干细胞转录组测序数据进行基因差异表达分析,发现217个差异表达基因;(3)对乳腺癌肿瘤干细胞差异表达基因进行基因通路富集分析,发现乳腺癌肿瘤干细胞与脂代谢、氨基酸表观修饰等通路显著相关。(5)(1)利用Kaplan meier生存分析网站提供乳腺癌患者术后随访信息,对乳腺癌肿瘤干细胞高表达的基因进行生存分析发现SAR1A等乳腺癌肿瘤干细胞高表达基因的表达水平和临床预后呈负相关。4.研究结论(1)体外单细胞微球形成模型能够有效富集乳腺癌肿瘤干细胞;(2)乳腺癌肿瘤干细胞AGXT2等97个基因突变频率显著高于非肿瘤干细胞;(3)乳腺癌肿瘤干细胞97个突变基因与ERBB2信号通路GRB2事件显著相关;(4)乳腺癌肿瘤干细胞m RNA水平存在显著差异表达基因;(5)乳腺癌肿瘤干细胞高表达基因和临床预后呈负相关。