杭白菊、野菊花和神农香菊抗氧化损伤作用及有效成分研究

来源 :湖北中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hailongsky
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目的:开展杭白菊、野菊花和神农香菊抗氧化作用研究,筛选抗氧化作用有效部位,鉴定抗氧化作用有效部位化学成分,探索抗氧化作用生物机制,为杭白菊、野菊花与神农香菊的合理应用和寻找天然抗氧化剂提供依据。方法:1.杭白菊(HBJ)、野菊花(YJH)和神农香菊(SNXJ)抗氧化作用研究及活性部位筛选。精密称取药材,以80%的乙醇提取2次,合并提取液,减压回收乙醇至无醇味,残留物为各供试药材总提物;精密称取各供试药材总提物适量,采用系统溶剂法,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,萃取液和水溶液分别减压回收溶剂,干燥,干燥物为各供试药材相应萃取部位;精密称取各供试药材萃取部位适量,制备成各供试药材不同萃取部位供试品溶液;分别采用DPPH法、ABTS法和FRAP法测定各供试药材总提物及不同萃取部位抗氧化效果,比较不同供试药材抗氧化活性,筛选其抗氧化活性部位。2.杭白菊、野菊花和神农香菊活性部位对模型细胞的保护作用研究。采用MTT法,以Hep G2细胞为模型细胞,以细胞存活率为指标,优化H2O2所致细胞氧化损伤模型的浓度和造模时间,形成稳定的氧化损伤细胞模型;采用试剂盒检测方法,测定氧化因子(MDA、ROS)、抗氧化物酶(CAT)和抗氧化物(GSH)含量,同时测定细胞存活率,考察各供试药材活性部位对H2O2所致细胞氧化损伤模型的保护作用,评价各供试药材活性部位抗氧化损伤效果。3.杭白菊、野菊花和神农香菊抗氧化损伤物质基础和作用机制初步研究。采用UPLC-QTOF-MS/MS技术,得到杭白菊、野菊花和神农香菊活性部位化合物总离子流图和质谱信号,鉴定各供试药材活性部位所含化合物;采用生物信息学方法,利用Swiss Target Prediction数据库预测各化合物的潜在作用靶点,以Gene Cards数据库检索氧化应激相关蛋白,综合分析潜在作用靶点和氧化应激相关靶点信息,筛选确定各化合物抗氧化应激作用靶点;对筛选确定的抗氧化应激靶点进行GO和KEGG富集分析,结合Cytoscape软件,构建“化合物-靶点-通路”网络图,利用拓扑分析,选择相互作用Degree值高的化合物和靶点作为核心成分和核心靶点;利用Autodock软件,以结合能为指标,对核心成分和核心靶点结合作用进行虚拟验证;采用酶联免疫(Elisa)测定法,以H2O2所致Hep G2细胞氧化损伤模型为受试对象,以核心靶蛋白表达量为指标,分析潜在活性化合物对核心靶点表达的影响,初步阐明各供试药材抗氧化损伤作用机制。结果:体外抗氧化试验结果表明抗氧化能力:杭白菊>野菊花>神农香菊,乙酸乙酯部位>正丁醇部位>总提物>石油醚部位≈水部位。乙酸乙酯部位为抗氧化活性部位。MTT法检测细胞活性表明HBJ组、YJH组和SNXJ组在20μg/m L以下浓度对Hep G2细胞活性无影响。800μmol/L H2O2处理Hep G2细胞4 h为最佳造模条件。HBJ组、YJH组和SNXJ组浓度为20μg/m L时,在氧化应激模型中表现出较好的保护作用。进一步研究发现,HBJ组、YJH组和SNXJ组预给药24 h后,能有效降低细胞中ROS含量和MDA含量,增加细胞内CAT活性和GSH含量。其中HBJ组效果最好,YJH组次之,SNXJ组最差。运用UPLC-QTOF-MS/MS技术,对杭白菊、野菊花和神农香菊乙酸乙酯部位化合物进行全面表征,共鉴别出22种化合物。其中黄酮及其苷类16种,苯丙素类6种。运用Swiss Target Prediction数据库预测22种化合物的对应的靶蛋白并与Gene Cards数据库中氧化应激相关蛋白取交集,共得47个交集靶点。分析利用Cytoscape软件构建“化合物-靶点-通路”网络图,再根据degree值进行排序,发现杭白菊、野菊花和神农香菊乙酸乙酯部位中黄酮类化合物是抗氧化应激的重要活性成分。其中排名前四的化合物Acacetin、Eupatilin、Kaempferol和Quercetin,分别与核心靶点NOX4、XDH、EGFR和MMP2有很强的结合能力。分析化合物对细胞活性的影响和对诱导氧化损伤细胞的保护作用,发现Kaempferol和Quercetin均能起到保护氧化损伤细胞的作用,且Kaempferol和Quercetin能显著下调MMP2和NOX4靶蛋白的表达。结论:杭白菊、野菊花和神农香菊乙酸乙酯部位抗氧化作用最强,并对H2O2诱导Hep G2细胞氧化损伤具有一定的保护作用。杭白菊、野菊花和神农香菊可能是通过Kaempferol和Quercetin等化合物作用于抗氧化应激核心靶点MMP2和NOX4从而达到抗氧化损伤作用。
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