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AMPK作为细胞能量感受器,对维持细胞代谢稳态具有重要作用。AMPK调控多种代谢过程,包括糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢和细胞自噬/线粒体稳态,都与AMPK的激活密不可分。运动、能源物质缺乏（无糖或无氧）、线粒体呼吸抑制剂（二甲双胍、鱼藤酮和CCCP）、AMPK激活剂AICAR和A-769662、991等皆可激活AMPK。为研究AMPK激酶复合物的调控机制,多数研究采用肌肉特定AMPKα1/α2基因单敲除或双敲除小鼠,损坏AMPKα蛋白结构和功能,致使AMPK及其下游效应物的失活和小鼠耐力运动能力受损。这是AMPKα蛋白某些特殊位点功能丧失导致的,还是AMPK蛋白复合物整体结构丢失造成的,并不十分清楚。本研究对AMPKα2 Thr172磷酸化位点进行点突变,培育出全身AMPKα2 T172A基因敲入小鼠（α2（T172A）KI）,该品系小鼠AMPKα的蛋白结构保持完整性,只是AMPKα2 Thr172磷酸化显著被抑制。通过该品系小鼠,可以进一步确证骨骼肌收缩对糖脂代谢发挥作用是否依赖AMPKα2 Thr172,为运动改善或治疗肥胖、2型糖尿病等代谢类疾病提供科学依据或精确靶点。目的:（1）基于野生型小鼠模型,进一步确认急性运动或电刺激引起的骨骼肌收缩对AMPK的激活作用及其下游的磷酸化效应。（2）基于AMPKα2T172A KI纯合子小鼠模型,探讨AMPKα2 Thr172磷酸化在骨骼肌收缩调控糖脂代谢中的必要性。（3）基于高脂膳食+STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型,探讨长期耐力运动训练改善骨骼肌糖脂代谢与AMPK信号通路的相关性。方法:1、急性运动对骨骼肌AMPK及其下游信号通路的激活作用为了验证急性运动对AMPK的激活作用,选取雄性C57BL/6J小鼠分为安静对照组（Sedentary,Sed）和急性运动组（Exercise,Ex）。运动方案为90min,5%坡度递增负荷式急性跑台运动,观察急性运动对骨骼肌AMPK及其下游效应物的影响。安静组小鼠在安静状态下取材,运动组小鼠在90min急性运动后即刻断颈处死,取材部位:跖肌。Western blot方法检测骨骼肌AMPKα（Thr172）、ACC（Ser79）、Ulk1（Ser555）、TBC1D1（Ser237）、TBC1D4（Ser318/Ser588/Thr642）和Akt（Ser473/Thr308）蛋白的激活。2、电刺激对骨骼肌AMPK及其下游信号通路的激活作用为了进一步确证运动激活AMPK是由于骨骼肌收缩直接导致,本研究采用不同频率、不同时间的电刺激引起骨骼肌收缩,观察电刺激对骨骼肌（腓肠肌）AMPK及其下游信号通路的激活作用。具体方案如下:（1）应用高频率短时间（100Hz 20min）和低频率长时间（10Hz 2h）电刺激,分别模拟抗阻运动和耐力运动,Western blot方法检测电刺激对骨骼肌AMPKα（Thr172）、ACC（Ser79）、TBC1D1（Ser237）、TBC1D4（Ser318/Ser588/Thr642）和Akt（Ser473/Thr308）蛋白的激活作用。同时观察100Hz30min电刺激和1.5U/ml胰岛素注射对小鼠骨骼肌GLUT4转位的作用。（2）根据100Hz（20min,1h和2h）和10Hz（20min,1h和2h）这些不同频率和时长的电刺激组合方案,Western blot方法检测电刺激频率和时长对骨骼肌AMPKα（Thr172）、ACC（Ser79）、TBC1D1（Ser237）和TBC1D4（Ser318/Ser588/Thr642）蛋白的磷酸化水平。3、AMPKα2 Thr172磷酸化在骨骼肌收缩调控糖脂代谢中的作用为了进一步确证运动和电刺激引起的骨骼肌收缩对AMPK及其下游通路的激活是否依赖Thr172位点的磷酸化,采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,定位小鼠AMPKα2 Thr172磷酸化位点进行单个DNA碱基点突变,将ACT编码的苏氨酸（Threonine,T）突变为GCT编码的丙氨酸（Alanine,A）,培育出AMPKα2（T172A）KI纯合子小鼠。（1）使用Echo MRI仪器测定小鼠体成分,使用OXYMAX代谢笼测定α2（T172A）KI纯合子小鼠和同窝野生型小鼠运动中和与运动后能量代谢参数。监测6天自由转轮运动和运动后3天恢复阶段α2（T172A）KI纯合子小鼠和同窝野生型小鼠不同时段RER、VO2、根据公式推算出葡萄糖氧化利用（carbohydrate utilization）和脂肪酸氧化利用（fat utilization）。（2）提取腓肠肌全细胞、细胞质和线粒体不同的细胞成分,观察急性运动对α2（T172A）KI纯合子小鼠骨骼肌AMPK的激活及其下游的磷酸化效应。Western blot方法检测骨骼肌AMPKα（Thr172）、ACC（Ser79）、Ulk1（Ser555）、TBC1D1（Ser237）、TBC1D4（Thr642）、Erk1/2（Thr202/Tyr204）蛋白的磷酸化水平以及Cox4和LC3II/I蛋白表达。冰冻切片和荧光免疫染色观察急性运动对小鼠骨骼肌GLUT4转位的影响。（3）运用低频率长时间（10Hz 2h）电刺激模拟耐力运动,观察电刺激对α2（T172A）KI纯合子小鼠AMPK的激活及其下游的磷酸化效应。Western blot方法检测骨骼肌AMPKα（Thr172）、ACC（Ser79）、TBC1D1（Ser237）和TBC1D4（Ser318/Ser588/Thr642）蛋白的磷酸化水平。4、长期运动训练对2型糖尿病（T2D）小鼠血糖以及骨骼肌AMPK信号通路的影响为了进一步确证长期运动训练改善2型糖尿病是否与骨骼肌AMPK激活及其下游磷酸化效应有关,采用C57BL/6J雄性小鼠进行4周高脂膳食（45%脂肪含量）和3次低剂量40mg/kg STZ腹腔注射进行T2D小鼠造模,T2D小鼠空腹血糖需超过11.1mmol/L。C57BL/6J健康雄性小鼠随机分为对照组（Con）、耐力训练组（ET）;T2D模型小鼠随机分为糖尿病对照组（DC）和糖尿病耐力训练组（DET）。运动方案如下:每天1小时70%VO2max,5天/周,8周跑台运动训练。测定所有组小鼠体重、8周运动期间空腹血糖、第8周空腹血糖和血清胰岛素,Western blot方法检测骨骼肌（腓肠肌）AMPKα（Thr172）、ACC（Ser79）、TBC1D1（Ser237）、TBC1D4（Thr642）和m TOR（Ser2448）蛋白的磷酸化水平以及GLUT4和CPT1蛋白表达。结果:1、急性跑台运动激活野生型小鼠骨骼肌AMPKαThr172及其下游效应ACC Ser79和Ulk1 Ser555磷酸化位点,同时上调骨骼肌TBC1D1 Ser237磷酸化。高频电刺激（100Hz 20min和1h）显著激活小鼠骨骼肌AMPK/ACC、TBC1D1和Akt信号通路,表现为AMPKαThr172、ACC Ser79、TBC1D1 Ser237和Akt Ser473磷酸化水平的显著增加。低频率电刺激（10Hz 20min和1h）显著激活小鼠骨骼肌AMPK/ACC和TBC1D1信号通路,表现为AMPKαThr172、ACC Ser79和TBC1D1 Ser237磷酸化水平的显著增加,同时10Hz 2h电刺激显著激活小鼠骨骼肌AMPKαThr172和Akt Thr308磷酸化位点。100Hz 30min电刺激促进骨骼肌GLUT4转位至细胞膜,表现为肌细胞膜上GLUT4免疫荧光增强。2、在运动后恢复阶段的白天时段AMPKα2（T172A）KI纯合子小鼠脂肪酸氧化利用显著低于同窝野生型小鼠,表现为α2（T172A）KI纯合子小鼠脂肪酸氧化利用下降50.4%。但AMPKα2（T172A）KI纯合子小鼠摄氧量水平、耐力运动能力与同窝野生型小鼠相比并无显著性差异。3、AMPKα2T172A KI纯合子小鼠骨骼肌全细胞、细胞质和线粒体的AMPKα2 Thr172位点的磷酸化显著下降,并且ACC Ser79和Ulk1 Ser555位点的磷酸化显著下降。AMPKα2T172A KI纯合子小鼠骨骼肌线粒体含量显著下降,急性运动诱导AMPKα2T172A KI纯合子小鼠骨骼肌细胞/线粒体自噬增加。急性运动上调野生型小鼠骨骼肌TBC1D1 Ser237磷酸化,促进GLUT4转位至细胞膜,但在AMPKα2T172A KI纯合子小鼠未见这一影响。4、低频率长时间电刺激（10Hz 2h）显著激活α2（T172A）KI纯合子小鼠和同窝野生型小鼠骨骼肌AMPK,并且AMPKα1的磷酸化水平显著高于AMPKα2。但10Hz 2h电刺激未上调α2（T172A）KI纯合子小鼠和同窝野生型小鼠骨骼肌ACC、TBC1D1和TBC1D4磷酸化水平。在电刺激条件下,α2（T172A）KI纯合子小鼠和同窝野生型小鼠骨骼肌ACC、TBC1D1和TBC1D4磷酸化水平没有显著性差异。5、8周中等强度跑台运动显著降低对照组小鼠体重,改善2型糖尿病小鼠空腹血糖和血清胰岛素水平。跑台运动上调健康对照小鼠骨骼肌AMPK Thr172和ACC Ser79位点的磷酸化水平,但未上调2型糖尿病小鼠骨骼肌AMPK Thr172、ACC Ser79、TBC1D1（Ser237）和TBC1D4（Thr642）位点的磷酸化水平,并且2型糖尿病小鼠骨骼肌GLUT4蛋白含量显著下降。结论:1、尽管急性运动和电刺激均能上调骨骼肌AMPKαThr172磷酸化,但下游磷酸化效应并不完全一致。高频率电刺激比低频率电刺激更能激活骨骼肌AMPK下游磷酸化效应。尽管2h超长时间低频率电刺激能上调AMPKαThr172磷酸化,但下游磷酸化效应几乎完全消失,这表明AMPK激活下游磷酸化可能是一过性的,超长电刺激可能引起AMPK作用顿化。2、尽管α2（T172A）点突变抑制AMPKα2 Thr172磷酸化、骨骼肌线粒体含量下降,但对小鼠摄氧量、运动耐力并无显著影响,只是在运动后恢复阶段削弱脂肪酸氧化能力,这表明AMPKα2 Thr172磷酸化对运动能力并非必要。在低频率长时间电刺激中AMPKα1的磷酸化水平显著高于AMPKα2,提示α2（T172A）点突变时AMPKα1可能补偿了AMPKα2的功能缺失。3、急性运动上调骨骼肌TBC1D1 Ser237磷酸化,促进GLUT4转位,这一过程可能依赖AMPKα2 Thr172位点的磷酸化。即使低频率长时间电刺激诱导骨骼肌AMPKα1的磷酸化上调,但ACC和TBC1D1磷酸化也只能依赖AMPKα2Thr172位点的磷酸化。4、长期运动改善2型糖尿病的血糖、胰岛素水平与AMPK的激活及其下游磷酸化效应不存在相关性,即运动不依赖AMPKαThr172位点磷酸化改善2型糖尿病。