热激蛋白(Heat shock protein,HSP)是植物在高温、盐渍、干早、饥饿和重金属离子等环境胁迫下诱导合成的一类应激蛋白。在逆境条件下,热激蛋白作为分子伴侣促进其他蛋白的重新折叠、稳定、组装、胞内运输和降解,促进受损蛋白的修复和细胞的存活,从而对植物耐受逆境胁迫起着非常重要的作用。根据分子量的大小可分为HSP100、HSP90、HSP70、 HSP60、sHSP (small HSP)五大类。热激蛋白70(HSP70)是热激蛋白家族中重要的成员,广泛分布于细胞质、内质网、线粒体和叶绿体等细胞的各个部分,正常情况下与应激条件下都发挥重要的生理功能。蜡梅[Chimonanthus praecox(L.)Link]为中国特有的珍贵花木,冬季开花、花香清幽,是冬季最佳的切花材料。蜡梅在园林观赏方面广泛应用,其药用价值及食用价值也得到开发和利用。近年来,对蜡梅分子生物学水平的研究受到广泛关注。但对植物HSP70家族蛋白基因的研究较少,我们获得新的蜡梅热激蛋白基因并对其功能进行相关研究,有利于进一步明晰植物HSP70家族蛋白的功能,同时对探究蜡梅在逆境胁迫下的抗逆机制也具有积极作用。本论文从实验室已经构建好的蜡梅花转录组数据库中筛选出2个HSP70家族基因的EST序列,分别命名为E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2,通过E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2两个基因的时空表达分析,以E-CpHSP70-1基因为进一步研究对象。利用RACE技术克隆到E-CpHSP70-1基因的全长序列,并对其进行生物信息学分析、亚细胞定位分析和在转基因烟草及拟南芥中的异位表达研究。主要研究结果如下：1.蜡梅E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2基因表达特征分析采用实时荧光定量PCR技术分析蜡梅E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2基因在不同组织、不同花发育时期及不同温度胁迫下的表达模式,蜡梅E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2基因的表达均具有时空差异性。蜡梅E-CpHSP70-2基因在各个组织表达有显著差异,在花器官中的表达量明显高于营养器官,在盛开期的外瓣中表达量最高。蜡梅E-CpHSP70-1基因在各个组织器官都有表达,尤其在成熟叶中的表达量最高,在花的萌动期和露瓣期也有高丰度表达,因此推测该基因很可能参与调控植物叶片和花发育过程。E-CpHSP70-1基因在4℃低温胁迫1h后相对表达明显增强,在42℃高温处理0.25h后,该基因表达量也迅速上调,而在处理1h后表达量达到最高,说明,蜡梅E-CpHSP70-1基因可能参与调控蜡梅的高低温胁迫响应过程。蜡梅E-CpHSP70-2基因在各个组织表达也有显著差异,在花器官中的表达量明显高于营养器官,在盛开期的外瓣中表达量最高。蜡梅E-CpHSP70-2基因在低温及高温胁迫下,表达与对照相比均无显著差异。2.蜡梅CpHSP70-1基因的克隆及生物信息学分析利用RACE技术从蜡梅花转录组数据库中克隆到一个热激蛋白HSP70家族基因,命名为CpHSP70-1(基因登录号为KR071130)。该基因cDNA全长2520bp,编码653个氨基酸,含有TATA Box、CAAAT Box和CAAT Box等元件,这些元件通过与热激因子HSF结合来调控热激蛋白基因的表达,以响应不同的环境刺激。CpHSP70-1基因编码蛋白与其他物种的HSP70蛋白同源性较高,与小果野芭蕉、荷花、葡萄、水稻、可可的同源性都高达96%。CpHSP70-1基因编码蛋白的氨基酸序列含有三个典型的HSP70家族典型基序,两个交叉螺旋氨基酸基序,一个指纹基序,一个细胞质定位特征基序。聚类结果表明,CpHSP70-1基因编码蛋白与定位于细胞核或细胞质的HSP70蛋白聚为一枝,推测该蛋白可能是一个细胞器蛋白。而且该蛋白不含信号肽,仅含有一个较小的跨膜区域,亚细胞定位预测显示该蛋白主要定位于细胞核,进一步说明CpHSP70-1基因编码蛋白可能在细胞核内起作用。CpHSP70-1基因编码蛋白的二级结构包括40.43%的α螺旋、7.81%的p折叠、31.85%的无规则卷曲和19.91%的延伸链。该蛋白具有14个丝氨酸(Serine)磷酸化位点、13个苏氨酸(Thremnine)磷酸化位点和5个酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位点,是一个亲水性蛋白,说明该蛋白可能在翻译后进行多种修饰作用,并且这些修饰作用在植物胁迫应答反应中起着重要作用。3.蜡梅CpHSP70-1亚细胞定位用BamHI和SalI快速内切酶分别对pMD 19-T/CpHSP70-1质粒和pCAMBIA 1300载体质粒进行双酶切,回收目的基因小片段和载体大片段后,连接并转化大肠杆菌,双酶切验证和PCR鉴定结果表明成功构建亚细胞定位表达载体pCAMBIA1300/CpHSP70-1,并采用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,瞬时表达结果表明CpHSP70-1蛋白在细胞核内表达。这也与基因的保守结构特征、聚类结果和亚细胞预测结果相吻合。4.蜡梅CpHSP70-1表达载体构建分别用BamHI和XbaI双酶切pMD 19-T/CpHSP70-1质粒和表达载体pCAMBIA2301G质粒,将回收目的片段连接,获得重组质粒pCAMBIA2301g/CpHSP70-1。5.蜡梅CpHSP70-1基因烟草以及拟南芥的遗传转化体系采用电击法,将含有目的基因的植物表达载体转化农杆菌GV3101,并通过农杆菌介导的叶盘法与花序侵染法分别转化烟草和拟南芥,经过卡那霉素(Kan)抗性筛选、GUS染色、DNA和RNA鉴定,获得9棵转基因烟草阳性植株和9个转基因拟南芥T3代纯合株系6.转CpHSP70-1基因植株的耐热性分析对不同表达量(高、中、低)的转基因烟草和转基因拟南芥进行耐热性分析和相关生理指标测定。烟草耐热性分析结果表明：野生型烟草植株在高温处理后叶片边缘卷曲、且出现萎焉、黄化现象,而转基因烟草表型无显著变化；相关生理指标测定结果表明,野生型烟草在高温胁迫后的MDA含量增幅比转基因烟草显著,其叶绿素分解速率也明显快于转基因烟草植株,而转基因烟草植株的脯氨酸含量和SOD活性增幅均大于野生型烟草。转基因拟南芥MDA、脯氨酸和SOD等生理指标结果与烟草变化趋势基本一致；且转基因拟南芥相对电导率在高温处理后变化幅度较野生型拟南芥小；另外,高温处理后转基因拟南芥种子萌发率明显高于野生型对照；下胚轴延伸长度也更显著；高温处理后野生型拟南芥平板幼苗和土壤幼苗均出现严重萎焉,且植株存活率远低于转基因拟南芥。对高温处理后CpHSP70-1基因在不同转基因株系中的表达情况进行实时荧光定量PCR检测,发现随着高温时间的延长,该基因在各个转基因株系叶片中的表达均呈上升趋势。说明高温处理条件下CpHSP70-1基因可能通过在转基因植株中的积累,影响了MDA、脯氨酸等的合成,继而提高了植株的耐热性。