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帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是第二大常见的神经退行性疾病,主要病理学特征是黑质(Substantia Nigra,SN)中脑多巴胺能神经元进行性丢失,纹状体(Striatum,Str)多巴胺(Dopamine,DA)含量减少导致运动症状。导致PD病理学改变的确切病因目前仍不清楚,遗传因素、环境因素、年龄老化导致的氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍、蛋白质异常聚集等等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。近年来,越来越多的证据表明,激活的小胶质细胞和星形胶质细胞导致持续的神经炎症反应是PD多巴胺能神经元退变的原因之一。在PD疾病状态下,星形胶质细胞激活可释放促炎细胞因子,并积聚α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn),这是多巴胺能神经元退变过程中的重要参与者。铁是大脑中最丰富的氧化还原活性金属,是各种生理过程的必需微量元素,包括氧转运(通过血红蛋白)、氧化还原反应、神经递质合成、髓鞘生成和许多线粒体功能。但是,由于铁易于释放电子并产生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),过多的铁蓄积会导致线粒体功能障碍、氧化应激和铁死亡,其和多巴胺之间的毒性组合是PD患者多巴胺能神经元易感性的重要原因之一。星形胶质细胞是神经血管单元不可缺少的元素,通过构成血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)来建立大脑中铁平衡的相对独立性,并可通过在突触环境中缓冲铁来调节突触活动。铁调素是脑铁稳态的调节因子,静脉注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)不仅可以调节外周器官铁调素的表达,还可以调节脑中铁调素的表达。在脑中,铁调素主要在星形胶质细胞中表达,并且炎症刺激后表达水平显著增加。当用铁调素肽治疗或感染铁调素表达的腺病毒时,星形胶质细胞表现出明显的铁摄取和释放减少。因此星形胶质细胞铁调素在控制铁通过BBB的转运和脑铁代谢中起关键作用。脂质运载蛋白2(Lipocalin 2,Lcn2)是分泌脂钙蛋白家族的成员,作为一种抑菌因子,在正常生理条件下,Lcn2可以借助哺乳动物铁载体转运铁,通过抑制微生物从哺乳动物宿主中获得铁而抑制细菌的生长。中枢神经系统中的Lcn2作为神经炎症的重要调节因子和铁调节因子,主要由胶质细胞释放并作用于周围微环境。生理条件下,正常的大脑几乎不表达Lcn2,但可被损伤或炎症明显上调。在神经毒素MPTP处理的小鼠SN和Str,Lcn2主要表达在反应性星形胶质细胞和一些活化的小胶质细胞。增加的Lcn2会导致神经毒性和神经炎症,并导致SN-Str多巴胺能系统投射受损和小鼠运动行为异常,这些症状在Lcn2敲除小鼠中得到改善。当使用外源性铁处理时,Lcn2诱导的神经毒性增加,但当使用铁螯合剂去铁胺(Deferoxamine,DFO)处理时,Lcn2诱导的神经毒性降低。Lcn2基因表达调控主要在转录水平,核因子κB(Nuclear Factor-Kappa B,NF-κB)是炎症基因表达的主要调节因子,也是Lcn2基因转录最重要的调节因子。本研究应用蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附测定、实时荧光定量PCR技术,在原代培养的星胶质细胞中,观察了LPS和α-syn两种致炎因素处理后细胞内肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-Alpha,TNF-α)、白介素1-β(Interleukin-1 Beta,IL-1β)mRNA和蛋白释放以及铁调素mRNA的变化。并应用铁负载试剂枸橼酸铁(Ferric Ammonium Citrate,FAC)造成细胞铁超载,铁螯合试剂DFO造成细胞内低铁,继续观察细胞内上述指标的变化。并观察细胞内铁水平变化对LPS诱导的Lcn2蛋白表达的影响,探讨自噬、蛋白酶体是否与Lcn2表达调控有关。研究结果如下:1.在原代星形胶质细胞中,与对照组相比,0.2μg/mL、1μg/mL LPS明显诱导TNF-α、IL-1βmRNA表达上调和蛋白释放增加(P<0.01,P<0.001),5μg/mLα-syn明显诱导TNF-αmRNA表达上调(P<0.001)和蛋白释放增加(P<0.01)以及IL-1βmRNA表达上调(P<0.001)但不影响释放。与对照组相比,FAC或DFO无论是单独处理还是预处理均不影响TNF-α、IL-1βmRNA表达和蛋白释放。与1μg/mL LPS组相比,FAC或DFO预处理均抑制了1μg/mL LPS诱导的TNF-α、IL-1βmRNA表达上调(P<0.001,P<0.01)但不影响释放。与5μg/mLα-syn组相比,DFO预处理抑制了5μg/mLα-syn诱导的TNF-αmRNA表达上调(P<0.01)但不影响释放,FAC或DFO预处理对于5μg/mLα-syn诱导的IL-1βmRNA和蛋白释放均没有影响。以上结果表明,致炎因素LPS或α-syn均可引起明显的炎症反应,FAC或DFO预处理虽然可以抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1βmRNA表达上调,但对LPS或α-syn引起的TNF-α、IL-1β蛋白释放均无影响。这些结果提示,细胞内铁水平对致炎因素LPS或α-syn引起的炎症反应影响不明显。2.在原代星形胶质细胞中,与对照组相比,0.2μg/mL、1μg/mL LPS上调了铁调素mRNA水平(P<0.01,P<0.05);FAC或DFO无论是单独处理还是预处理均不影响铁调素mRNA水平。与1μg/mL LPS组相比,FAC或DFO预处理均抑制了1μg/mL LPS诱导的铁调素mRNA水平(P<0.05)。1μg/mL、5μg/mLα-syn单独处理不改变铁调素mRNA水平,然而,与5μg/mLα-syn组相比,FAC预处理抑制了5μg/mLα-syn诱导的铁调素mRNA水平(P<0.05);DFO预处理升高了5μg/mLα-syn铁调素mRNA水平(P<0.001)。以上结果表明,铁调素mRNA的表达受到致炎因素LPS的调控,且细胞内铁水平可改变致炎因素LPS或α-syn对铁调素mRNA的表达调控。3.在原代星形胶质细胞中,与对照组相比,0.2μg/mL、1μg/mL LPS上调铁蛋白蛋白表达(P<0.05),1μg/mL、5μg/mLα-syn处理也上调铁蛋白蛋白表达(P<0.05,P<0.01),FAC或DFO单独处理可上调或下调铁蛋白蛋白表达(P<0.05,P<0.001)。与1μg/mL LPS组相比,FAC或DFO单独处理分别上调或下调1μg/mL LPS诱导的铁蛋白蛋白表达(P<0.05),与5μg/mLα-syn组相比,FAC或DFO预处理分别上调或下调5μg/mLα-syn诱导的铁蛋白蛋白表达(P<0.01,P<0.05)。以上结果表明,铁蛋白蛋白表达受致炎因素和细胞内铁水平的调控。4.在原代星形胶质细胞中,与对照组相比,无论是0.2μg/mL、1μg/mL LPS单独处理,还是FAC或DFO预处理再与1μg/mL LPS共处理均降低了铁调素mRNA与铁蛋白蛋白的比值(P<0.05)。与对照组相比,单独1μg/mL、5μg/mLα-syn处理,降低了二者的比值(P<0.05,P<0.01),与5μg/mLα-syn组相比,FAC预处理后再与5μg/mLα-syn共处理进一步降低了二者的比值(P<0.01),DFO预处理后再与5μg/mLα-syn共处理升高了二者的比值(P<0.001)。以上结果表明,细胞内铁水平不影响铁调素mRNA水平,致炎因素和细胞内铁水平影响铁蛋白蛋白表达,铁调素mRNA与铁蛋白蛋白的比值能更好的反映原代星形胶质细胞受致炎因素和细胞内铁水平的双重调控。5.在原代星形胶质细胞中,与对照组相比,0.2μg/mL、1μg/mL LPS明显诱导了Lcn2蛋白表达(P<0.01),5μg/mLα-syn明显诱导了Lcn2蛋白表达(P<0.001),FAC或DFO无论是单独处理还是预处理,Lcn2蛋白表达均未改变。与1μg/mL LPS组相比,FAC预处理没有改变1μg/mL LPS诱导的Lcn2蛋白表达,DFO预处理下降了1μg/mL LPS诱导的Lcn2蛋白表达(P<0.01)。与5μg/mLα-syn组相比,FAC或DFO预处理均没有改变5μg/mLα-syn诱导的Lcn2蛋白表达。在BV2小胶质细胞中,与对照组相比,1μg/mL LPS明显诱导了Lcn2蛋白表达(P<0.001),FAC或DFO无论是单独处理还是预处理,Lcn2蛋白表达均未改变,与1μg/mL LPS相比,FAC或DFO预处理也没有改变1μg/mL LPS诱导的Lcn2蛋白表达。以上结果表明,致炎因素LPS或α-syn可以诱导Lcn2蛋白表达上调,DFO可以下降原代星形胶质细胞中LPS诱导的Lcn2蛋白表达。6.在原代星形胶质细胞中,与LPS组相比,自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)预处理抑制LPS诱导的Lcn2蛋白表达上调(P<0.05),与FAC或DFO共同预处理也可抑制LPS诱导的Lcn2蛋白表达上调(P<0.001),与DFO+LPS组相比,RAPA对DFO抑制LPS诱导的Lcn2蛋白表达上调的效应没有影响。与LPS组相比,自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)预处理不改变LPS诱导的Lcn2蛋白表达上调,与FAC共同预处理也没有改变LPS诱导的Lcn2蛋白表达上调,与DFO预处理下降了LPS诱导的Lcn2蛋白表达。但与DFO+LPS组相比,CQ对DFO抑制LPS诱导Lcn2蛋白表达上调的效应没有影响。以上结果表明,自噬可能不参与DFO对LPS诱导的Lcn2上调的抑制作用。7.在原代星形胶质细胞中,与LPS组相比,蛋白酶体抑制剂MG132无论是单独预处理还是与FAC或DFO共同预处理均完全阻断LPS诱导的Lcn2蛋白表达上调(P<0.001)。同时,与对照组相比,LPS可上升p-NF-κB/NF-κB比值(P<0.01),与LPS组相比,MG132预处理可阻断LPS诱导的p-NF-κB/NF-κB比值上升(P<0.05)。但是DFO预处理没有下降LPS诱导的p-NF-κB/NF-κB比值。以上结果表明,蛋白酶体、NF-κB通路可能不参与DFO对LPS诱导的Lcn2上调的抑制作用。以上结果表明,LPS和α-syn均可诱导原代星形胶质细胞出现炎症反应,表现为促炎细胞因子TNF-αmRNA表达上调和蛋白释放增加。LPS或α-syn均可引起明显的炎症反应,FAC或DFO预处理虽然可以抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1βmRNA表达上调,但对LPS或α-syn引起的TNF-α、IL-1β蛋白释放均无影响。铁调素mRNA的表达受到致炎因素LPS调控,且细胞内铁水平可改变致炎因素LPS或α-syn对铁调素mRNA以及其与铁蛋白蛋白的比值的表达调控。LPS可以明显诱导Lcn2的蛋白表达,细胞内铁缺乏状态可抑制LPS诱导的原代星形胶质细胞中Lcn2蛋白表达上调。自噬、蛋白酶体、NF-κB通路可能不参与DFO对LPS诱导的Lcn2蛋白表达上调的抑制作用。本实验将为明确星形胶质细胞Lcn2在PD疾病状态下受致炎因素和细胞内铁水平影响的表达调控机制,为其参与PD发病和作为可能的药物治疗靶点提供实验支持。