【摘 要】
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[目的]探讨精液凝固蛋白Ⅰ（semenogelin I,SgⅠ）的衍生肽SgI-52在精子免疫清除中的作用,并揭示SgI-52是否参与自然受精精子筛选过程,以了解其在女性生殖道内环境的作用,为辅助生殖技术（Assisted reproductive technology,ART）中的精子优化提供了一个新的靶向。[方法]1.巨噬细胞的诱导:通过培养THP-1细胞,并在六孔板中用PMA诱导48h将其转
【基金项目】
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云南省科技厅一昆明医科大学应用基础研究联合专项基金（2019FE001[-005]）；
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[目的]探讨精液凝固蛋白Ⅰ（semenogelin I,SgⅠ）的衍生肽SgI-52在精子免疫清除中的作用,并揭示SgI-52是否参与自然受精精子筛选过程,以了解其在女性生殖道内环境的作用,为辅助生殖技术（Assisted reproductive technology,ART）中的精子优化提供了一个新的靶向。[方法]1.巨噬细胞的诱导:通过培养THP-1细胞,并在六孔板中用PMA诱导48h将其转化成巨噬细胞。2.精子的收集和处理:2021年4月至11月,根据WHO指南分析了同意参加本研究的5名男性弱精子症不育患者和5名正常健康男性受试者。采用Percoll不连续密度的梯度法分离精子和精浆,用BWW培养基将精子重悬并分成四组（正常健康精子对照组、正常健康精子实验组、弱精子症精子对照组和弱精子症精子实验组）。在实验组加入终浓度为4mg/ml的SgI-52,对照组中加入等量的去离子水。3.SgI-52的荧光标记:将正常健康精子和弱精子症精子用BWW培养基重悬后,调整精子浓度为10×106/ml,加入终浓度为4mg/ml的SgI-52-FITC分别孵育0min、1min、15min和30min后,取适量精子悬液用Hoechst染色10min,PBS漂洗两次,用70%的甘油重悬并制成玻片,于共聚焦显微镜下观察拍照。4.巨噬细胞吞噬精子的荧光标记:将正常健康精子用BWW培养基重悬后,调整精子浓度为30×106/ml,平均分成两组,实验组加入终浓度为4mg/ml的SgI-52-FITC,对照组加入等量的去离子水。两组精子在孵箱中孵育4h后,加入Hoechst染色,PBS漂洗两次,BWW培养基重悬并调整浓度。加入到预先用Dil染色的巨噬细胞中孵育1h。取出六孔板中的玻片,滴加抗荧光淬灭剂后避光风干,于共聚焦显微镜下观察拍照。5.巨噬细胞吞噬精子的差异:将结合和非结合SgI-52的正常健康精子和弱精子症精子四组精子孵育4h和22h后加入到六孔板中与巨噬细胞共孵育30min后,PBS洗去未被吞噬的精子。用迪夫快速染色试剂盒进行染色,并在光学显微镜下拍照和计数。6.精子的运动能力:精子与SgI-52在BWW培养基共孵育4h和22h后,使用计算机辅助精液分析系统分别检测精子的运动参数。7.诱发顶体反应:将正常健康精子悬浮液分成三等份,实验组中加入SgI-52和10μM钙离子载体A23187（溶于DMSO）刺激;对照组加入10μM钙离子载体A23187和去离子水;空白组则加入DMSO和去离子水。孵育30min后,4%甲醛固定,PBS漂洗后,考马斯亮蓝染色,制成玻片风干后,于光学显微镜下拍照和计数。8.精子平均ATP含量:将正常健康精子分成两组,实验组加入SgI-52,对照组加入等计量的去离子水。两组精子在BWW培养基中孵育4h,用精子ATP检测试剂盒进行检测。[结果]1.SgI-52可以与精子的结合,从尾部开始结合,并随着时间的延长扩散到头颈部和顶体。2.正常健康精子结合和不结合SgI-52均可被巨噬细胞吞噬,并且一个巨噬细胞可吞噬多个精子。3.SgI-52可以促进精子被巨噬细胞吞噬。（P＜0.05）4.SgI-52可以抑制正常健康精子和弱精子症精子的运动能力。（P＜0.05）5.SgI-52对精子获能无统计学意义。（P＞0.05）6.SgI-52可以提高正常健康精子的平均ATP含量。（P＜0.05）[结论]人精液凝固蛋白Ⅰ衍生肽SgI-52能结合精子,促进巨噬细胞对精子的吞噬,抑制了精子的运动能力,减少了正常健康精子ATP的使用。
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